Search the digital library catalog

Abstract: V okviru zaključnega dela smo izvedli optimizacijo imobilizacije l-asparaginaze (l-ASNaze) na aminoksilanske magnetne nanodelce (AMN-MNPs). Postopek imobilizacije sestoji iz dveh korakov, funkcionalizacije AMN-MNPs in imobilizacije encima. V prvem koraku smo funkcionalizirali AMN-MNPs, v drugem koraku smo nanje imobilizirali l-ASNazo. Najprej smo v teoretičnem delu opisali lastnosti l-ASNaze, prikazali njeno strukturo, mehanizem delovanja in uporabo v različnih panogah. V nadaljnje smo opisali imobilizacijo na magnetne nanodelce (MNP), pri čemer smo se osredotočili na AMN-MNPs. Podan je tudi pregled literature o imobilizaciji l-ASNaze na MNPs. Pri eksperimentalnem delu smo proučevali vpliv različnih parametrov, kot so koncentracija mrežnega povezovalca glutaraldehida (GA), vrtilna hitrost, čas in temperatura imobilizacije, z namenom doseganje čim višje aktivnosti imobiliziranega encima in učinkovitost imobilizacije. Zanimalo nas je kakšno aktivnost encima dosežemo ob dodatku ogrodnih proteinov, ki delujejo kot stabilizatorji. Uporabili smo goveji serumski albumin (BSA) in albumin iz jajčnih beljakov (EA). V nadaljnje smo proučili termično stabilnost proste in imobilizirane l-ASNaze pri različnih časih inkubacije in pri različnih temperaturah. Prosto in imobilizirano l-ASNazo smo vzpostavili na magnetno polje in primerjali aktivnosti l-ASNaze pred in po vzpostavitvi.
Keywords: l-asparaginaza, magnetni nanodelci, stabilnost, kovalentna vezava, funkcionalizacija, imobilizacija
Published in DKUM: 02.10.2024; Views: 0; Downloads: 10
Full text (2,82 MB)

Abstract: Encimi so biološke molekule, sestavljene iz enega ali več polipeptidnih verig, ki se zvijejo v specifične tridimenzionalne oblike. Njihova specifična tridimenzionalna struktura omogoča vezavo substratov na aktivna mesta, kjer se izvajajo katalitične reakcije. Specifičnost encimov izhaja iz natančnega prileganja med encimom in substratom, kar pogosto opisujemo s pojmom "ključ-ključavnica". Vsak encim je tako usmerjen k določenemu substratu ali vrsti reakcije, kar omogoča visoko stopnjo regulacije in učinkovitosti v bioloških sistemih. Veliko prednost predstavlja imobilizacija encimov na trdne nosilce, kar omogoča njihovo ponovno uporabo in izboljša stabilnost ter učinkovitost encima. Uporaba imobiliziranih encimov je zaradi lažjega ločevanja od reakcijskih zmesi in posledično nižjih stroškov procesa vse bolj zaželena v industrijskih in biotehnoloških panogah. Encim transglutaminaza (TGM) se uporablja v različnih panogah, veliko vlogo ima predvsem v medicini in živilski panogi, kjer ga pogosto uporabljajo za izboljšanje teksture mesa, mlečnih izdelkov in drugih prehrambenih izdelkov. Diplomsko delo najprej zajema proizvodnjo micelarnih struktur z gojenjem medicinske gobe Ganoderma lucidum v tekočem hranilnem mediju s sladnim in kvasnim ekstraktom pri 28 °C pri statičnih pogojih. Za tvorbo micelarnih struktur je bilo potrebno gojiti G. lucidum 14 dni. Povprečna debelina micelarnih struktur je bila 0,493 mm, povprečna masa pa 3,961 g. Proizvedene micelarne strukture so izkazale visoko sposobnost absorbiranja vode z doseženim odstotkom nabrekanja po 24 h 579,3 %. S FTIR analizo smo potrdili prisotnost proteinov, lipidov in polisaharidov, s SEM analizo pa prisotnost por in hif v micelarnih strukturah. Povprečni premer por je znašal 40 µm, povprečni premer hif pa 425 nm. V nadaljevanju študije smo izvedli stabilizacijo terapevtskega encima TGM z imobilizacijo na sintetizirane micelarne strukture z metodo adsorpcije in določili učinkovitost in zmogljivost ujetja encima. Najvišja učinkovitost imobilizacije TGM v micelarne strukture je znašala 41,98 % , kar ustreza masi vgrajenega encima 8,97 g. S študijo sproščanja smo ugotovili, da se je encim uspešno adosrbiral, saj se encim niti po 24 h ni sprostil iz micelarnih struktur. Najverjetneje je adsorbirana TGM v micelarne strukture katalizirala tvorbo kavalentnih vezi med proteini in je prišlo do zamreženja TGM v notranjosti micelarnih struktur, ki vsebuje tudi proteine. Zato smo proučili potek encimske reakcije z imobiliziranim encimom v micelarne strukture pri različnih koncentracijah substrata in kinetiko imobiliziranega encima primerjali s kinetiko prostega encima. Določili smo kinetična parametra, kot sta Michaelis-Mentenova konstanta (KM) in maksimalna reakcijska hitrost (vmax) za prostiin imobilizirani encim z Lineweaver-Burkovim diagramom. Pri tem smo ugotovili, da ima sicer imobiliziran encim slabšo afiniteto do substrata kot prosti encim, zaradi višje izračunane vrednosti KM in nižje vmax. Sledilo je proučevanje vpliva mase ujetega encima na potek encimske reakcije v odvisnosti od časa. Ugotovili smo, da z naraščanjem mase imobiliziranega encima, reakcija, torej pretvorba substrata v produkt, poteka hitreje. Pri najvišji možni ujeti masi encima (8,97 mg ) v micelarne strukture smo dosegli plato, saj ni bilo zaznati signifikantnih razlik med profilom poteka encimske reakcije med 8,97 mg (13 mg/mL) in 8,76 mg ujetega encima (10 mg/mL). Imobilizacija encima na trdni nosilec je primerna za številne aplikacije. Z uspešno imobilizacijo encima TGM v micelarne strukture medicinske gobe G. lucidum, smo pripravilli stabilen funkcionalizirani naravni biokompozit, ki se lahko uporabi za različne biomedicinske aplikacije, predvsem za celjenje ran.
Keywords: Ganoderma lucidum, micelarne strukture, encimi, transglutaminaza, imobilizacija, encimski test
Published in DKUM: 26.09.2024; Views: 0; Downloads: 4
Full text (4,26 MB)

Abstract: Namen magistrskega dela je uspešna imobilizacija encima lizocima na magnetne nanodelce. Praktična uporaba prostih encimov je pogosto omejena zaradi njihove relativno nizke stabilnosti in aktivnosti. Z namenom, da se le-ta ohrani ali poveča, se poslužujemo različnih metod imobilizacije encimov. V okviru magistrskega dela smo najprej sintetizirali magnetne nanodelce, ki so služili kot nosilci za imobilizacijo biokatalizatorja. Nanodelce smo prevlekli z različnimi polimeri: z aminosilanom, arabinogalaktanom in dekstranom. Preden smo nanje imobilizirali lizocim, smo jih funkcionalizirali z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom oziroma epiklorohidrinom. Uporabljena koncentracija mrežnega povezovalca je pomembno vplivala na aktivnost imobiliziranega lizocima in na učinkovitost imobilizacije. Najvišje aktivnosti imobiliziranega lizocima smo pri aminosilanskih nanodelcih dosegli, ko smo uporabili mrežni povezovalec gluteraldehid s koncentracijo 1 % (v/v), pri arabinogalaktanskih nanodelcih pa s koncentracijo 15 % (v/v). V primeru dekstranskih nanodelcev je optimalno koncentracijo mrežnega povezovalca predstavljal 1 % (v/v) epiklorohidrina. Za prosti in imobilizirani lizocim smo nato določili dva kinetična parametra, maksimalno hitrost in Michaelis-Mentenovo konstanto. Raziskali smo tudi termično stabilnost lizocima. Rezultati so pokazali, da je imobilizirani lizocim ohranil aktivnost tudi po 24-urni izpostavitvi pri temperaturi 50 °C, medtem ko je prosti encim pri enakih pogojih denaturiral. Proučili smo tudi stabilnost imobiliziranega encima, ki smo ga tri tedne hranili na 4 °C. Encim, ki je bil imobiliziran na aminosilanskih in arabinogalaktanskih nanodelcih, je po dveh tednih skladiščenja ohranil 86 % oziroma 78 % začetne aktivnosti, po treh tednih skladiščenja pri 4 °C pa je njegova aktivnost upadla. Lizocim, imobiliziran na dekstranske nanodelce, se je tako pri študiji termične stabilnosti kot tudi pri študiji stabilnosti pri 4 °C izkazal za najmanj stabilnega.
Keywords: lizocim, imobilizacija, magnetni nanodelci, mrežni povezovalec, aktivnost
Published in DKUM: 25.07.2024; Views: 152; Downloads: 48
Full text (2,03 MB)

Abstract: Namen magistrskega dela je predstaviti pomen encima β-laktamaze za javno zdravje, kemijske in fizikalne metode imobilizacije encimov ter magnetne nanodelce kot nosilce za imobilizacijo encimov. V okviru naloge smo izvedli imobilizacijo β-laktamaze na magnetne nanodelce, ki se lahko uporablja za razgradnjo antibiotikov. β-Laktamaza razgrajuje antibiotike z β-laktamskimi obroči, natančneje peniciline, cefalosporine in karbapeneme. V okviru raziskovalnega dela smo uspešno sintetizirali aminosilanske magnetne nanodelce, ki smo jih uporabili za imobilizacijo encima. Z dodajanjem mrežnih povezovalcev in stabilizacijskih proteinov ter s spreminjanjem sinteznih parametrov, kot so temperatura, pH, vrtilna hitrost in čas imobilizacije, smo določili optimalne parametre za imobilizacijo obravnavanega encima na magnetne nanodelce. Pri raziskovalnem delu smo tako uporabili 20 mg aminosilanskih nanodelcev in encim β-laktamazo s koncentracijo 0,01 mg/mL. Ugotovili smo, da je optimalen dodatek mrežnega povezovalca glutaraldehida 10 % (v/v), optimalen dodatek govejega seruma albumina 25 % (v/v), vrtilna hitrost 450 rpm in čas imobilizacije dve uri. Proučevali smo tudi stabilnost prostega in imobiliziranega encima. Izvedli smo tudi študijo večkratne uporabe imobiliziranega encima. Po petnajstih ciklih ponovne uporabe je imobilizirani encim ohranil 12,3 % svoje začetne aktivnosti.
Keywords: imobilizacija encima, magnetni nanodelci, β-laktamaza, β-laktamski antibiotiki, mrežni povezovalec
Published in DKUM: 10.10.2023; Views: 497; Downloads: 135
Full text (2,32 MB)

Abstract: V diplomski nalogi je prikazana študija imobilizacije encima na poliHIPE material, poli(glicidilmetakrilat-ko-etilenglikol dimetakrilat). Najprej smo pripravili poliHIPE materiale z različnimi deleži vodne faze (med 75 vol% in 90 vol%) in zamreževala (15 mol% in 30 mol%). Nato pa smo ustrezno očiščen in okarakteriziran material (FTIR spektroskopija, elementna analiza, vrstična elektronska mikroskopija in adsorpcijskaporozimetrija) uporabili kot nosilec za encim lipazo, katerega smo uporabili kot biokatalizator za hidrolizo 4-nitrofenil butirata. Za ta namen smo uporabili dve vrsti lipaze, lipazo Aspergilius niger in Candida cylindracea. Poli(glicidilmetakrilat-ko-etilenglikol dimetakrilatne) monolite smo uspešno sintetizirali s polimerizacijo emulzije z visokim deležem notranje faze tipa voda v olju. Oljna (organska, monomerna oz. zunanja) faza emulzije je vsebovala monomer glicidil metakrilat, zamreževalo etilenglikol dimateakrilat, iniciator azobisizobutironitril in surfaktant Pluronica L 121. Kot notranjo fazo smo uporabili 1,8% vodno raztopino kalcijevega klorida heksahidrata. Polimerne monolite smo okarakterizirali in funkcionalizirali. S karakterizacijo smo potrdili vključenost obeh monomerov v polimerne verige in njihovo porozno strukturo. Funkcionalizirali smo jih z nukleofilno substitucijo z encimom lipazo. Uspešnost reakcije smo preverili z elementno analizo in testno reakcijo, hidrolizo 4-nitrofenil butirata v p-nitrofenol in butirično kislino. Elementna analiza je pokazala vsebnost dušika v polimeru z vezanim (imobiliziranim) encimom, medtem ko dušika pri osnovnem polimeru elementni analizator ni zaznal. Da je bila imobilizacija encima uspešna smo potrdili tudi z reakcijo hidrolize in sicer z nastankom rumenega kompleksa p-nitrofenola, ki se pri katalizi s polimerom brez encima ni formiral.
Keywords: poliHIPE materiali, emulzije z visokim deležem notranje faze, encim, lipaza, imobilizacija, hidroliza 4-nitrofenil butirata
Published in DKUM: 23.09.2022; Views: 673; Downloads: 114
Full text (2,67 MB)