Iskanje po katalogu digitalne knjižnice

Opis: Ekstracelularni vezikli (EV) so majhni membranski delci, ki jih celice sproščajo v zunajcelični prostor in so nosilci signalnih molekul. Zaradi svoje vloge pri medcelični komunikaciji in potenciala kot biooznačevalci so predmet številnih raziskav. Za njihovo poglobljeno karakterizacijo je ključna masna spektrometrija (MS), ki pa zahteva učinkovite izolacijske protokole, saj kompleksnost plazme pogosto zakrije njihove nizko zastopane proteine. V magistrskem delu smo razvili in optimizirali metodo za izolacijo EV iz človeške krvne plazme, ki omogoča zanesljivo proteomsko analizo z LC-MS/MS. Uspešnost izolacije smo ovrednotili s številom identificiranih proteinov v pripravkih EV v primerjavi s surovo in osiromašeno plazmo ter z detekcijo značilnih označevalcev EV v skladu s smernicami MISEV. Vzporedno smo primerjali pristope za zajem podatkov, klasično DDA in več različic sodobnejše DIA metode ter optimizirali kromatografske pogoje za čim širše zajetje proteoma. Prvi poskus izolacije z namizno centrifugo ni pokazal razlik med EV in plazmo, je pa omogočili optimizacijo kromatografije in potrdil, da DIA pristop omogoča več identifikacij kot DDA. Nadaljnja izolacija z ultracentrifugo na saharozni blazini je omogočila delno obogatitev EV, zato smo nadalje povečali vhodno količino plazme in protokol še dodatno izpopolnili. Kot optimalen se je izkazal postopek za izolacijo EV iz 2 mL krvne plazme z ultracentrifugiranjem na saharozni blazini v kombinaciji z analizo na LC-MS/MS pri 90-minutniem OptiStep gradientu in DIA zajemom podatkov s 24 zaporednimi MS2 okni. S tem protokolom smo v EV pripravkih identificirali tipične označevalce EV (CD9, CD81, CD82, TSG101, PDCD6IP, FLOT1/2) in skupno več kot 1 000 proteinov, medtem ko smo jih v plazmi pri enakih pogojih identificirali največ 300. Poleg ločenih analiz posameznih vzorcev smo preizkusili tudi možnost sočasnega zajema podatkov, kjer so bili hkrati analizirani EV, plazma in osiromašena plazma. Rezultati so pokazali, da ta pristop poveča informacijsko vrednost plazme, zaznali smo kar 56 % več proteinov kot pri samostojni analizi. Optimiziran pristop izolacije omogoča poglobljeno proteomsko analizo EV in odpira nove možnosti za odkrivanje biooznačevalcev. Pristop sočasne analize pa ponuja praktično rešitev za obravnavo večjega števila plazemskih vzorcev, saj ob le nekaj pripravkih EV omogoča bogatejši nabor podatkov iz plazme za biomedicinske in klinične raziskave.
Ključne besede: krvna plazma, ekstracelularni vezikli, proteomika, masna spektrometrija, DIA
Objavljeno v DKUM: 29.09.2025; Ogledov: 0; Prenosov: 30
Celotno besedilo (5,58 MB)