Iskanje po katalogu digitalne knjižnice

Opis: Dinamična fosforilacija in defosforilacija proteinov sta esencialna regulatorna mehanizma, ki regulirata večino celične fiziologije, zato ni presenetljivo, da so motnje v njunem delovanju pogosto vzrok za nastanek in napredovanje številnih bolezni. Fosfoproteomika je biološko pomembno področje, ki za analizo fosfoproteinov pogosto uporablja tekočinsko kromatografijo, sklopljeno s tandemsko masno spektrometrijo (LC MS/MS). Pred analizo z LC-MS/MS je ključnega pomena obogatitev fosforiliranih peptidov, ki zviša relativno količino ciljnih molekul in s tem poveča občutljivost metode. V magistrski nalogi smo optimizirali metodo obogatitve fosforiliranih peptidov za analizo z masno spektrometrijo, pri čemer smo izhajali iz nezadovoljivega protokola proizvajalca. Na voljo smo imeli dva obogatitvena materiala: PureCube Fe-NTA MagBeads in PureCube Ti-NTA MagBeads, katerih kapaciteto smo primerjali. Ugotovili smo, da je v naši izvedbi eksperimenta veliko obetavnejša obogatitev s Ti-NTA magnetnimi kroglicami, ki so že na začetku optimizacije ponujale zadovoljiv delež obogatenih fosfopeptidov, medtem ko bi za uporabo Fe-NTA morali bistveno spremeniti sestavo vezavnega pufra. Optimizirali smo razmerje med količino Ti-NTA in maso vhodnih peptidov ter delež glikolne kisline (GA) v vezavnem pufru. Rezultati kažejo, da z večjo količino afinitetnega materiala obogatimo več fosforiliranih peptidov, brez zmanjšanega deleža le-teh v vzorcu, zato smo kot optimalno določili dvakratno količino Ti-NTA glede na prvotni protokol. Nadalje smo ugotovili, da dodatek GA občutno vpliva na specifičnost vezave, vendar večji delež le-te hkrati obogati manj fosfopeptidov. Kompromis med zvišanjem specifičnosti in večjim številom fosfopeptidov smo tako dosegli pri uporabi vezavnega pufra z 0,2 % deležem GA. Na podlagi alternativnih protokolov in teorije smo prilagodili tudi inkubacijski čas vezave in elucije fosfopeptidov. Nadalje smo ugotavljali minimalno maso vhodnih peptidov, iz katere še dobimo zanesljivo kvantifikacijo fosfopeptidov. Ugotovili smo, da je ta lahko veliko nižja kot navaja proizvajalec; minimalno maso smo postavili pri 50 g, saj nižje mase dajejo zelo variabilne in s tem nezanesljive rezultate. Optimizirano metodo smo testirali na peptidih iz celic, gojenih v različnih pogojih. Analizirali smo fosfoproteom celic, tretiranih s kemoterapevtikom doksorubicin, napram celicam v normalnih rastnih pogojih. Statistična analiza je pokazala, da se je ob izpostavljenosti doksorubicinu količina številinih fosforiliranih peptidov statistično značilno povečala. Uporabljen masni spektrometer se je izkazal za dovolj občutljivega, da te spremembe zazna, optimizirana metoda pa kot učinkovita. Metoda je tako primerna za proučevanje fosfoproteoma, ko imamo opravka z manjšim številom vzorcev, pred širšo uporabo pa bo potrebna dodatna optimizacija.
Ključne besede: proteomika, fosforilacija, obogatitev fosfopeptidov, masna spektrometrija
Objavljeno v DKUM: 12.09.2024; Ogledov: 21; Prenosov: 59
Celotno besedilo (3,68 MB)