Iskanje po katalogu digitalne knjižnice

Opis: Namen magistrskega dela je uspešna imobilizacija encima lizocima na magnetne nanodelce. Praktična uporaba prostih encimov je pogosto omejena zaradi njihove relativno nizke stabilnosti in aktivnosti. Z namenom, da se le-ta ohrani ali poveča, se poslužujemo različnih metod imobilizacije encimov. V okviru magistrskega dela smo najprej sintetizirali magnetne nanodelce, ki so služili kot nosilci za imobilizacijo biokatalizatorja. Nanodelce smo prevlekli z različnimi polimeri: z aminosilanom, arabinogalaktanom in dekstranom. Preden smo nanje imobilizirali lizocim, smo jih funkcionalizirali z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom oziroma epiklorohidrinom. Uporabljena koncentracija mrežnega povezovalca je pomembno vplivala na aktivnost imobiliziranega lizocima in na učinkovitost imobilizacije. Najvišje aktivnosti imobiliziranega lizocima smo pri aminosilanskih nanodelcih dosegli, ko smo uporabili mrežni povezovalec gluteraldehid s koncentracijo 1 % (v/v), pri arabinogalaktanskih nanodelcih pa s koncentracijo 15 % (v/v). V primeru dekstranskih nanodelcev je optimalno koncentracijo mrežnega povezovalca predstavljal 1 % (v/v) epiklorohidrina. Za prosti in imobilizirani lizocim smo nato določili dva kinetična parametra, maksimalno hitrost in Michaelis-Mentenovo konstanto. Raziskali smo tudi termično stabilnost lizocima. Rezultati so pokazali, da je imobilizirani lizocim ohranil aktivnost tudi po 24-urni izpostavitvi pri temperaturi 50 °C, medtem ko je prosti encim pri enakih pogojih denaturiral. Proučili smo tudi stabilnost imobiliziranega encima, ki smo ga tri tedne hranili na 4 °C. Encim, ki je bil imobiliziran na aminosilanskih in arabinogalaktanskih nanodelcih, je po dveh tednih skladiščenja ohranil 86 % oziroma 78 % začetne aktivnosti, po treh tednih skladiščenja pri 4 °C pa je njegova aktivnost upadla. Lizocim, imobiliziran na dekstranske nanodelce, se je tako pri študiji termične stabilnosti kot tudi pri študiji stabilnosti pri 4 °C izkazal za najmanj stabilnega.
Ključne besede: lizocim, imobilizacija, magnetni nanodelci, mrežni povezovalec, aktivnost
Objavljeno v DKUM: 25.07.2024; Ogledov: 152; Prenosov: 65
Celotno besedilo (2,03 MB)

Opis: Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) iz encima transglutaminaze. Pri tem smo želeli doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost encima transglutaminaze. Sinteza je zajemala postopek obarjanja encima v izbranem obarjalnem reagentu in zamreženja encima z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA). Da bi dosegli čim boljše rezultate smo morali izbrati ustrezen obarjalni reagent ter njegovo količino. Optimirali smo parametre pri zamreženju, kot so koncentracija dodanega mrežnega povezovalca, koncentracija dodanega natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN), koncentracija ogrodnih proteinov govejega serumskega albumina (BSA) in jajčnega albumina (EA) ter koncentracija transglutaminaze. Iz rezultatov smo ugotovili, da je 2-propanol najbolj ustrezen obarjalni reagent za sintezo CLEAs iz transglutaminaze. Optimalni volumski procent obarjalnega reagenta je bil 92,4 % (v/v), kar znaša 1215 μl. Za optimalne rezultate smo uporabili raztopino encima s koncentracijo 150 mg/ml s 100 mg/ml EA. Encimske molekule smo zamrežili z 2 % (v/v) GA ob 3 urnem mešanju. Za boljšo stabilnost encima smo dodali 200 μl 0,1 M NaBH3CN. Ugotovili smo, da lahko tako imobilizirano transglutaminazo kot katalizator reakcije uporabimo trikrat z aktivnostjo encima nad 100 % preden se deaktivira.
Ključne besede: transglutaminaza, zamreženi encimski skupki, imobilizacija, mrežni povezovalec, glutaraldehid
Objavljeno v DKUM: 18.09.2017; Ogledov: 1479; Prenosov: 116
Celotno besedilo (1,88 MB)

Opis: Namen diplomskega dela je bil pripraviti aktivne zamrežene encimske skupke (CLEAs) in magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEAs) iz encima β-galaktozidaze ter pri tem doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostanek aktivnosti encima β-galaktozidaze. Pri tem smo optimirali parametre, da smo prišli do čim boljših rezultatov. Priprava CLEAs in mCLEAs je bila sestavljena iz postopka obarjanja in zamreženja. Pri obarjanju smo med drugim preučevali, katera organska topila so se izkazala kot najboljši obarjalni reagenti. Zamreženje pa smo optimirali s spreminjanjem časa in temperature. Ugotovili smo, da so najboljši obarjalni reagenti za pripravo CLEAs etanol, aceton, 1-propanol in 2-propanol, za pripravo mCLEAs pa etanol, 1-propanol in 2-propanol. Optimalni pogoji za pripravo CLEAs in mCLEAs so koncentracija encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in 2-urno zamreženje pri 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca glutaraldehida (GA). Ugotovili smo tudi, da so CLEAs in mCLEAs pri 2-urni izpostavljenosti na 50°C še stabilni, medtem ko pri izpostavljenosti na 70°C njihova aktivnost upade.
Ključne besede: β-galaktozidaza, zamreženi encimski skupki, mrežni povezovalec, obarjanje, zamreženje, imobilizacija
Objavljeno v DKUM: 04.10.2016; Ogledov: 1851; Prenosov: 263
Celotno besedilo (1,99 MB)

Opis: V diplomskem delu je opisana sinteza encimskih skupkov ali agregatov iz encima celulaza, katere na kratko imenujemo CLEAs (Crosslinked enzyme aggregates). Zamrežene encimske skupke smo pripravili po že znanem postopku, ki je sestavljen iz dveh ključnih delov. Prvi del predstavlja oboritev encima s pomočjo obarjalnega reagenta, ki je lahko organsko topilo ali raztopina anorganske soli. Temu sledi zamreženje oborjenega encima s pomočjo zamrežitvenega reagenta. Glutaraldehid je organska molekula in se najpogosteje uporablja kot zamrežitveni reagent, predvsem zaradi enostavne uporabe in relativno nizke nabavne cene. Pri sintezi CLEAs smo optimirali parametre z namenom izboljšanja relativne aktivnosti encimskih agregatov. V fazi obarjanja smo ugotavljali, kateri so tisti obarjalni reagenti, ki nam ne povzročijo ireverzibilne denaturacije, saj s tem deaktiviramo encim in izgubimo nativno aktivnost encima. Na koncu smo določili tudi stabilnost sintetizirane CLEAs, s poskusi ponovne uporabe imobiliziranega encima. Z eksperimentalnim delom smo uspešno sintetizirali zamrežene encimske skupke iz encima celulaze. Sintezo smo izvajali pri sobni temperaturi z uporabo pufra PBS (20 mM in pH = 7), s koncentracijo albumina γalbumin = 17 mg/mL in z Vrazt. celulaze = 100 µL. Za obarjanje smo uporabili 90 % delež topil, ki smo mu smo dodali 10 % delež encima celulaze. Uporabljeni obarjalni reagenti so: metanol, etanol, propanol, 2-propanol, aceton, amonijev sulfat, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid, polietilen glikol (PEG 1500, 6000, 20000), kloroform, n-heptan, heksan, dimetileter, butanol, acetonitril in dekanol. V stopnji zamreženja smo uporabili tiste obarjalne reagente, kjer je bilo obarjanje uspešno. Zamreženje je potekalo 3 ure. Ugotovili smo, da je bila najvišja aktivnost CLEAs pri uporabi obarjalnega reagenta etanola in pri koncentraciji glutaraldehida ϕ = 0,0625 %. Končni produkt sinteze CLEAs je bila motna suspenzija, kjer je bila povprečna velikost agregatov 43 µm. Kljub visoki aktivnosti smo ugotovili, da CLEAs ni stabilna, saj dobimo razpolovno dobo encima že po 2. ciklu. V začetni fazi raziskave smo sintetizirali CLEAs s sicer nižjo aktivnostjo, vendar so bili dobljeni agregati stabilnejši. S tem smo ovrgli trditev, da je aktivnejša CLEAs tudi stabilnejša.
Ključne besede: zamreženi encimski skupki, CLEAs, celulaza, mrežni povezovalec, glutaraldehid, obarjalni reagenti
Objavljeno v DKUM: 21.10.2015; Ogledov: 2079; Prenosov: 155
Celotno besedilo (1,96 MB)

Opis: Delo opisuje sintezo aktivnih encimskih skupkov ali agregatov iz encima α — amilaze in postopek zamreženja le — teh z glutaraldehidom, z namenom priprave končne oblike stabilnih zamreženih encimskih skupkov ali na kratko CLEAs. V splošni praksi je postopek priprave zamreženih encimskih skupkov razdeljen na dva ključna dela, in sicer, na precipitacijo topnega oziroma nativnega encima s pomočjo ustreznega organskega topila ali nasičene anorganske soli ter na nadaljnjo zamreženje tako izoborjenega encima s pomočjo zamrežitvenega agensa. Iz literature je znano, da je glutaraldehid, kot homobifunkcionalna organska molekula, najbolj pogosto uporabljen zamrežitveni agens, ker je relativno poceni in je njegova uporaba zelo enostavna. Pri postopku denaturacije oziroma obarjanja nativnega encima je potrebno preizkusiti čim več različnih denaturantov, z namenom, da se ugotovi, kateri uporabljeni denaturant ne povzroči ireverzibilne denaturacije encima, oziroma zagotovi, da je po ponovni resuspenziji izoborjenega encima v vodni raztopini aktivnost encima ponovno blizu 100 %. V našem primeru smo uspešno sintetizirali zamrežene encimske skupke iz α — amilaze. Aktivnost CLEAs smo določili z reakcijo hidrolize vodotopnega škroba. Optimalni reakcijski pogoji sinteze zamreženih encimskih skupkov so bili doseženi pri koncentraciji encima α — amilaze γα-amilaza = 8 mg/mL in koncentraciji encima albumina (BSA) γBSA = 8 mg/mL. Za obarjanje smo uporabili φ = 90 % (v/v) delež različnih topil in φ = 10 % (v/v) delež raztopljenega encima. Obarjalna agensa, metanol in etanol, v katerih je encim obdržal najvišjo aktivnost, sta bila izbrana za naslednji korak — zamreženje. Reakcija zamreženja je potekala t = 3 h pri sobni temperaturi. Ugotovljeno je bilo, da je bila aktivnost zamreženih skupkov iz encima α — amilaze najvišja pri koncentraciji glutaraldehida φ = 1 % (v/v) in metanolu kot obarjalnemu reagentu. Končni videz raztopine zamreženih encimskih agregatov je podoben motni suspenziji, v kateri so jasno vidni skupki encimov značilne sferične oblike in premera okrog 1 µm. Tehnika za sintezo zamreženih encimskih agregatov je zelo enostavna in nasploh zelo obetavna metoda na področju imobilizacij različnih encimov.
Ključne besede: zamreženi encimski skupki, CLEAs, α – amilaza, mrežni povezovalec, glutaraldehid
Objavljeno v DKUM: 22.12.2009; Ogledov: 4193; Prenosov: 287
Celotno besedilo (17,82 MB)