1. Povezava epigenetskih in ekspresijskih markerjev pri raku glave in vratu : diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnjeMonika Ostroško, 2020, diplomsko delo Opis: Rak glave in vratu predstavlja obsežno skupino bolezni, v katero uvrščamo raka ustnic, ustne in nosne votline, žrela, grla, vratu in nekatere druge. Med temi tumorji opazimo velike razlike, ne le zaradi mesta izvora, marveč prihaja tudi do različnih simptomov bolezni, hitrosti širjenja, različni so načini zdravljenja ter izidi bolezni. V pomoč pri postavljanju diagnoze, spremljanju obnašanja tumorja in pravilnem izboru zdravljenja se uporabljajo biološki označevalci. V telesu prisotnost teh snovi, ki jih ustvari tumor ali zdrave celice kot reakcijo na tumor, odkrijemo s pomočjo laboratorijske preiskave bioloških vzorcev.
V diplomskem delu smo želeli izmeriti ekspresijo genov DAPK1 in MMP9 v zdravih in bolnih tkivih ter vzpostaviti protokole za metilacijsko analizo gena DAPK1. Genska ekspresija in metilacija sta povezana biološka procesa, saj metilacija vpliva na vezavo specifičnih transkripcijskih faktorjev na DNA, ti pa uravnavajo izražanje genov. Pri raziskovanju nas je zanimalo, če bi lahko DAPK1 in MMP9 služila kot možna biološka označevalca pri bolnikih z rakom glave in vratu. Za ugotavljalnje izražanja teh genov v zdravih in bolnih tkivih smo uporabili metodo qRT-PCR. Za analizo metilacijskih vzorcev na promotorju gena DAPK1 smo testirali dve občutljivi in specifični tehniki za določanje metilacije DNA, metodo MS-HRM ter metodo COBRA. Za analizo metilacije promotorja DAPK1 pri 15 bolnikih smo nato uporabili metodo COBRA.
Rezultati genske ekspresije pri 47 bolnikih z rakom glave in vratu so pokazali statistično signifikantno znižanje DAPK1 v rakavih tkivih v primerjavi z zdravimi tkivi istih pacientov, medtem ko rezultati MMP9 kažejo na statistično signifikantno povečanje ekspresije v rakavih tkivih. Z merjenjem genske ekspresije smo prišli do zaključka, da sta gena DAPK1 in MMP9 zanimiva kot potencialna biološka markerja pri raku glave in vratu. Zaradi majhnega števila bolnikov, ki so bili vključeni v metilacijsko analizo, nismo mogli postaviti zaključkov o metiliranosti promotorja DAPK1. Za jasne zaključke bodo potrebne nadaljne analize.
Ključne besede: rak glave in vratu, biološki označevalci, DAPK1, MMP9, genska ekspresija, metilacija
Objavljeno v DKUM: 08.10.2020; Ogledov: 1109; Prenosov: 120
 Celotno besedilo (2,35 MB) |
2. Optimizacija procesiranja vzorcev sline pri raku glave in vratu za študije bioloških označevalcevTeja Ermenc, 2018, diplomsko delo Opis: Namen diplomske naloge je bil optimizirati pridobivanje genetskega materiala iz vzorcev sline pri bolnikih z rakom glave in vratu za analizo bioloških označevalcev. Ustna tekočina oz. slina vsebuje genetski material, celice in različne molekule, ki lahko odražajo bolezenske spremembe. Zaradi tega bi lahko ustna tekočina služila kot stroškovno učinkovita in manj invazivna alternativa biopsiji za zgodnje odkrivanje raka.
Za izolacijo nukleinskih kislin in proteinov iz krvi obstaja na Centru za humano genomiko in farmakogenomiko Medicinske fakultete v Mariboru že ustaljen postopek, za izolacijo iz sline pa ta še ni bil vzpostavljen. V nalogi smo želeli pripraviti laboratorijske protokole za učinkovito pridobivanje nukleinskih kislin in proteinov iz izpirkov ustne votline s TRI-reagentom. V ta namen smo na vzorcih moje sline testirali različne izolacijske pogoje, kot so različna količina sline, različne količine reagentov, izolacija iz ustnega izpirka ali iz peleta ustnega izpirka. Ugotovili smo, da je iz peletiranega izpirka možno izolirati tako DNA kot RNA, vendar je RNA slabše kvalitete in vsebuje precej razgradnih produktov, najverjetneje zaradi delovanja ribonukleaz v slini. Vzpostavljen postopek izolacije smo nato uporabili na vzorcih izpirkov ustne votline bolnikov z rakom glave in vratu. Po pričakovanjih so izolati DNA in RNA kazali precejšnjo stopnjo razgradnje, saj so vzorci pred zamrznjenjem nekaj časa čakali na sobni temperaturi v zdravniški ordinaciji. Izolati DNA so bili dovolj kvalitetni za genotipizacijo in metilacijske analize, integriteta RNA pa je bila prenizka za analize genske ekspresije. Predvidevamo, da bi z odvzemanjem izpirkov neposredno v stabilizacijsko raztopino lahko izboljšali kvaliteto izolatov.
Ključne besede: rak glave in vratu, biološki označevalci, izolacija iz sline, metilacija
Objavljeno v DKUM: 05.10.2018; Ogledov: 1430; Prenosov: 164
Celotno besedilo (1,71 MB) |
3. Ekspresijski in epigenetski vzorci pri bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijoIris Kelc, 2018, diplomsko delo Opis: Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je dolgotrajno (kronično) obolenje črevesja, ki je imunsko pogojeno. Med KVČB uvrčamo dve bolezni, ki sta si precej podobni, to sta Crohnova bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK), v 10-15% pa bolezni ne moremo razvrstiti v prejšnji skupini, zato jo uvrščamo v intermediarni kolitis (KI) [1]. Vzroki za KVČB še niso dodobra pojasnjeni, vendar pa so odvisni od okoljskih in genetskih dejavnikov. KVČB uvrščamo med kompleksne kronične imunske bolezni, med katere sodijo tudi nekatera druga obolenja, kot so revmatoidni artritis, multipla skleroza itd. Bolezen KVČB zdravijo na več načinov, v današnjih časih pa dajejo velik poudarek na biološka zdravila, ki so večinoma zelo učinkovita, vendar pa pri nekaterih pacientih opažamo neodzivnost.
V diplomskem delu smo se lotili analize ekspresijskih in epigenetskih profilov pri slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo na anti-TNF terapiji z adalimumabom (ADA). Cilj je bila identifikacija kandidatnih biooznačevalcev, ki bi predvideli bolnikovo odzivnost na tovrstno biološko zdravljenje. Odločili smo se za testiranje gena AXIN1. V študiji pri bolnikih z revmatoidnim artritisom, ki je tako kot KVČB kronična vnetna avtoimuna bolezen, je bila namreč dokazana različna stopnja metiliranosti tega gena pri odzivnikih in neodzivnikih na adalimumab [2]. Tako kot pri KVČB, tudi pri RA uporabljajo biološke terapije in pri obeh je približno 20-40 % neodzivnikov na tako terapijo [3], [4].
Ugotovili smo, da je pri bolnikih s KVČB statistično značilno povečanje izražanje gena za AXIN1 v primerjavi z zdravimi kontrolami, vendar je razlika zelo majhna, med odzivniki in neodzivnki pa ni bilo opaziti razlik. Za namen epigenetskih študij smo pripravili različne metilacijske kontrole in poskusili optimizirati metilacijske teste. Ker naše epigenetske analize niso dale jasnih končnih rezultatov, bodo potrebne nadaljnje preiskave.
Ključne besede: KVČB, adalimumab, odzivniki, neodzivniki, AXIN1, genska ekspresija, metilacija
Objavljeno v DKUM: 26.04.2018; Ogledov: 2466; Prenosov: 133
Celotno besedilo (2,21 MB) |
4. RAČUNALNIŠKE SIMULACIJE VPLIVA METILACIJE CITOZINA NA VEZAVO AFLATOKSINA B1 V DVOVERIŽNO DNKKatarina Kores, 2016, diplomsko delo Opis: Aflatoksini so metaboliti gliv iz družine Aspergillus, ki jih pogosto najdemo v nepravilno skladiščenih žitaricah, koruzi in oreščkih. Aflatoksin B1 je eden najbolj kancerogenih mikotoksinov, zato je raziskovanje njegovih vplivov in posledic zelo pomembno, saj bi lahko na tak način zmanjšali ali celo preprečili zastrupitve. Študij aflatoksina B1 je v znanstveni literaturi že veliko, saj se zelo rad kemijsko veže v dvojno vijačnico DNK, kjer povzroča nadaljnje mutacije.
V diplomski nalogi smo se osredotočili na enega od dejavnikov, ki bi potencialno lahko vplival na afiniteto vezave aflatoksina B1, to je metilacija citozina v CpG območju samega vezavnega mesta. Tu imamo dva citozina na komplementarnih verigah DNK, zato smo imeli štiri možne kombinacije metiliranih citozinov, torej štiri obravnavane sisteme. Raziskovanja smo se lotili s pomočjo računalniških simulacij.
Za določitev delnih nabojev 5-metil citozina smo uporabili ab initio metodi Hartree-Fock in RESP. Za simulacije molekulske dinamike (MD) smo ustrezne empirične parametre prevzeli iz AMBER-jevih topoloških in parametrskih knjižnic. Topologijo molekule aflatoksina B1 smo pridobili od kolega Tiborja Kune. Simulacije MD (5,4 ns) smo izvedli s programskih paketom Q, iz dobljenih trajektorij pa smo po metodi LIE izračunali vezavne Gibbsove proste energije. Prav tako smo spremljali število dogodkov, kjer je razdalja med vezavnima atomoma C8 (aflatoksin B1) in N7 (gvanin) znotraj odrezne razdalje, iz česar smo nato sklepali, ali bi kovalentna vez lahko nastala.
Rezultati kažejo, da imamo pri vseh sistemih potencialne možnosti za nastanek kovalentne vezi med vezavnima atomoma. Izračuni po metodi LIE pa kažejo, da med posameznimi sistemi ni signifikantnih razlik v interkalacijskih prostih energijah molekule aflatoksina B1.
Ključne besede: DNK, aflatoksin B1, metilacija citozina, molekulska dinamika, prosta energija, interkalacija
Objavljeno v DKUM: 16.09.2016; Ogledov: 1963; Prenosov: 165
Celotno besedilo (2,49 MB) |
5. ANALIZA METILACIJE TUMOR SUPRESORSKIH GENOV PRI RAKU GLAVE IN VRATUStaša Hamzić Gregorčič, 2015, magistrsko delo Opis: Rak glave in vratu predstavlja heterogeno skupino malignih tumorjev. Mednje uvrščamo malignome nosu, obnosnih votlin, ustne votline, žrela, grla in žlez slinavk. Ti tumorji se med seboj razlikujejo ne le po mestu, od koder izvirajo, temveč tudi po bolezenskih znakih, histološki sliki, načinu in pogostosti metastaziranja, hitrosti napredovanja ter ne nazadanje tudi po načinu zdravljenja in izidu bolezni. Resno ogrožajo bolnikovo življenje, hkrati pa prizadenejo del telesa z izredno pomembnimi fiziološkimi funkcijami, ki so bistvenega pomena v človekovem psihičnem, emocionalnem in socialnem življenju.
V nastanek raka sta vpleteni predvsem dve skupini genov, in sicer protoonkogeni in tumor supresorski geni. Prvi so med procesom karcenogeneze spodbujeni k čim večjemu izražanju, medtem ko so drugi spremenjeni tako, da je njihovo izražanje zmanjšano ali da je njihov produkt funkcionalno neaktiven. Na sam proces karcenogeneze vplivajo tudi drugi dejavniki, ki ne povzročajo sprememb v nukleotidnem zaporedju DNA in jih imenujemo epigenetski dejavniki.
Epigenetski dejavniki se izražajo predvsem tako, da celico vzpodbujajo in jo stalno silijo v izražanje določenih genov. Med karcenogenezo se spremeni metilacija protoonkogenov, tumor supresorskih genov ter genov, ki so odgovorni za popravljalne mehanizme DNA v celici. Hipermetilirajo in s tem se utišajo tumor supresorski geni ter geni, odgovorni za popravljanje nastalih napak na DNA. Hipometilirajo in s tem se aktivirajo protoonkogeni in geni, odgovorni za tumorsko metastaziranje.
Namen magistrske naloge je analiza mutacij in metilacije tumor supresorskih genov pri raku glave in vratu. Določali smo tudi prisotnost humanih papiloma virusov (HPV) v tumorskih vzorcih, saj je predvideno, da je status metilacije povezan s HPV povezanimi tumorji raka glave in vratu. Uporabili smo referenčne vzorce zdravega tkiva in testne vzorce tumorskega tkiva. V študijo je bilo vključenih 59 bolnikov, starih med 46 in 80 let. Okužbo s HPV smo odkrili pri petih bolnikih. Mutacije v tumor supresorskem genu predstavljajo povečano verjetnost za nastanek raka v ORL področju. Za testiranje prisotnosti mutacij v tumor supresorskem genu smo uporabili metodo metilacije specifičnega hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih prob, MS – MLPA. Pri 49 bolnikih je bila ugotovoljena prisotnost metilacije v več kot enem genu. Najpogosteje hipermetilirani geni so RARB, TIMP3, DAPK1 in CDH13, in jih lahko povežemo z razvojem raka glave in vratu. Pravočasno odkrivanje mutacij v genih, povezanih z nastankom raka, je za nosilce mutacij pomembno, saj je dokazana mutacija razlog za prilagojeno klinično spremljanje in preventivne ukrepe pri nosilcih mutacije.
Ključne besede: Rak glave in vratu, ORL področje, protoonkogeni, tumor supresorski geni, metilacija, hipermetilacija, HPV, MS – MLPA.
Objavljeno v DKUM: 24.12.2015; Ogledov: 2349; Prenosov: 284
Celotno besedilo (2,88 MB) |
