Iskanje po katalogu digitalne knjižnice

Opis: V diplomskem delu sta predstavljena danes najpogostejša načina priprave vzorcev proteinov z razgradnjo na peptide za proteomsko analizo z masnim spektrometrom: SDS PAGE in stopenjska priprava v raztopini, ki vključuje denaturacijo, redukcijo, alkilacijo proteinov in njihovo cepitev na peptide s tripsinom. Naš namen je bil skrajšati, poenostaviti in poceniti v znanstveni literaturi opisani protokol stopenjske priprave vzorcev proteinov v raztopini, vendar kljub temu ohraniti dobro razgradnjo proteinov in identifikacijo z masnim spektrometrom. V delu je tako podrobneje prikazana analiza optimizacije priprave vzorcev v raztopini: različni reagenti, različne koncentracije, združevanje korakov, dodajanje korakov, različne temperature in različno dolge inkubacije. Rezultati kažejo, da protokola ne moremo skrajšati na račun časa inkubacije tripsina, vendar pa lahko to storimo z združitvijo korakov denaturacije, redukcije in alkilacije ter skrajšanim časom inkubacije teh korakov. Kot boljši alkilacijski reagent se je v primerjavi z jodoacetamidom (IAM) zaradi manjšega števila neželenih modifikacij izkazal kloroacetamid (CAM), za oba reagenta pa je primerna koncentracija pod 10 mM. Ugotovili smo, da dodaten korak prekinitve alkilacije z ditiotreitolom (DTT) zaradi prihranka časa in kemikalij ni primeren, saj ne zmanjša števila neželenih modifikacij. Povzeti protokol smo nekoliko pocenili z zamenjavo alkilacijskih reagentov, saj je kloroacetamid (CAM) cenejši in ga je na voljo za več eksperimentov, sicer pa ceno celotnega eksperimenta določa predvsem poraba tripsina, čigar cena znaša okrog 2,23 EUR za 1 μL.
Ključne besede: proteomika, SDS PAGE, in-solution-digestion, reagenti, masna spektroskopija, priprava vzorcev
Objavljeno v DKUM: 31.03.2023; Ogledov: 649; Prenosov: 50
Celotno besedilo (4,45 MB)