Iskanje po katalogu digitalne knjižnice

Opis: Doktorska disertacija je razdeljena na dva sklopa, v katerih smo razširili dosedanje raziskave na področju priprave magnetnih nanodelcev, njihove funkcionalizacije in imobilizacije encimov na tako pripravljene mikro- in nanonosilce. Osrednji cilj disertacije je priprava magnetnih nanodelcev z metodo obarjanja ali koprecipitacije železovih (II) in železovih (III) ionov v alkalnem mediju, funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih metodah; metodi mikroemulzije, suspenzijske zamreževalne tehnike in kovalentne vezave. Podrobna karakterizacija tako pripravljenih nosilcev je bila izvedena s pomočjo presevne elektronske mikroskopije, vrstične elektronske mikroskopije, rentgenske praškovne difrakcije, z dinamičnim sipanjem laserske svetlobe, laserskim granulometrom in merjenjem specifične magnetizacije. Tako smo opazovali morfologijo in lastnosti magnetnih nosilcev. Površinsko funkcionalizacijo s hitozanom za doseganje višje funkcionalnosti smo potrdili s pomočjo energijskodisperzijske spektroskopije, termične analize, potenciometrične titracije in s Fourierevo transformacijo. Z mikrobiološkim testiranjem je bil določen vpliv magnetnih mikro- in nanonosilcev na rast mikrobnih kultur. Nadalje smo magnetne mikro- in nanodelce, prevlečene s plastjo hitozana, uporabili kot nosilce za imobilizacijo holesterol oksidaze (EC 1.1.3.6). S spreminjanjem različnih pogojev, kot so koncentracija encima, koncentracija in vrsta mrežnega povezovalca glutaraldehida ali pentaetilen heksamina ter hitrost stresanja, smo ugotovili, kako se spreminja učinkovitost imobilizacije encima ter kolikšen delež aktivnosti se pri tem ohrani v primerjavi s prostim encimom. Aktivnost imobilizirane holesterol oksidaze smo določili z reakcijo oksidacije holesterola. Optimalni reakcijski pogoji imobilizacije holesterol oksidaze na magnetne mikro- in nanonosilce so bili doseženi pri koncentraciji encima 1 mg/mL ob uporabi 0,02 M pentaetilenheksamina kot mrežnega povezovalca. Aktivnost imobilizirane holesterol oksidaze pri optimalnih reakcijskih pogojih je bila 79,03 %. Prav tako je bila stabilnost imobilizirane holesterol oksidaze pri ponovni uporabi dobra. V drugem sklopu je opisana priprava zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze (EC 3.2.1.4). Postopek priprave zamreženih encimskih skupkov vključuje dva pomembna koraka, in sicer obarjanje encima z dodatkom obarjalnega reagenta in zamreženje encimskih molekul z glutaraldehidom. Optimalni reakcijski pogoji sinteze zamreženih encimskih skupkov so bili doseženi pri koncentraciji glutaraldehida 0,0625 % (v/v) in uporabi etanola kot obarjalnega reagenta. Aktivnost imobilizirane celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov smo določili z reakcijo hidrolize celuloze. Aktivnost imobilizirane celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov pri optimalnih reakcijskih pogojih je bila 93,95 %. Prav tako je bila stabilnost imobilizirane celulaze pri ponovni uporabi dobra.
Ključne besede: magnetni nanodelci, imobilizacija encimov, hitozan, holesterol oksidaza, celulaza, zamreženi encimski skupki.
Objavljeno v DKUM: 16.09.2015; Ogledov: 2429; Prenosov: 226
Celotno besedilo (4,76 MB)

Opis: V doktorski nalogi je nazorno predstavljen postopek sinteze magnetnih nanodelcev iz železovega oksida maghemita, γ-Fe2O3, za vezavo biokatalizatorja. Magnetni nanodelci, ki v zadnjih letih vse bolj pridobivajo na vrednosti kot potencialni encimski nosilci, so bili najprej sintetizirani z metodo obarjanja ali koprecipitacije železovih (II, Fe2+) in železovih (III, Fe3+) ionov v alkalnem mediju pri hitrem mešanju in visoki temperaturi. Površinska funkcionalizacija magnetnih nanodelcev je bila izvedena v dveh stopnjah. Primarna funkcionalna prevleka iz silicijevega dioksida (SiO2), ki delcem daje predvsem višjo stabilnost, je bila sintetizirana pri striktno kontroliranih reakcijskih pogojih iz natrijevega silikata ali Na2SiO3. Sekundarni funkcionalni sloj za doseganje višje funkcionalnosti in reaktivnosti površine nanodelcev je bil sintetiziran iz organskih molekul aminosilana ali 3-(2-aminoetilamino)-propil-dimetoksimetilsilana v kislem mediju. V nadaljnjem so bili tako površinsko spremenjeni magnetni nanodelci uporabljeni za imobilizacijo specifičnega biokatalizatorja holesterol oksidaze (ChOx, EC 1.1.3.6) iz Corynebacterium sp. Analiza magnetnih nanodelcev z imobilizirano ChOx je pokazala, da so imeli nanodelci značilno obliko kroglice ali sfere s povprečnim premerom 50,2 nm. Vezava holesterol oksidaze je bila uspešno potrjena tudi s FT-IR tehniko. Učinkovitost imobilizacije na magnetni nosilec je znašala 92 % pri uporabljeni koncentraciji encima 100 µg mL-1. Aktivnost imobilizirane ChOx na magnetne nanodelce, prevlečene s tanko plastjo silikatne prevleke premera 3 nm, je bila 57 % v primerjavi z aktivnostjo ChOx. Študija vpliva pH-vrednosti in temperature na aktivnost in stabilnost encimskega preparata je pokazala, da ima imobilizirana ChOx višjo toleranco na spremembo pH-vrednosti okolja in višjo termično stabilnost. Prav tako je bila stabilnost imobilizirane ChOx pri ponovni uporabi dobra. V drugem delu doktorske disertacije je opisana priprava aktivnih encimskih skupkov iz encima peroksidaze (HRP, EC 1.11.1.7), pridobljenega iz navadnega hrena (lat.: Armoracia rusticana or Cochlearia armoracia), in postopek zamreženja le-teh z glutaraldehidom za pripravo končne oblike stabilnih zamreženih encimskih skupkov ali na kratko CLEAs. Postopek priprave CLEAs je bil razdeljen na dva ključna dela, in sicer, na obarjanje topnega ali nativnega encima s pomočjo ustreznega obarjalnega reagenta, in na nadaljnjo zamreženje tako izoborjenega encima s pomočjo mrežnega povezovalca. Končni videz CLEAs je podoben motni suspenziji, v kateri so jasno vidni skupki encimov, značilne sferične oblike in premera okrog 250 nm. Uspešno smo sintetizirali zamrežene encimske skupke iz hrenove peroksidaze pod različnimi testnimi pogoji. Končna aktivnost encimskih skupkov iz HRP je bila 83 %. Zamrežene encimske skupke smo sintetizirali v prisotnosti encima albumina iz kokošjih jajc in funkcionalnega aditiva, penta-etilen-heksanamina (PEHA). Encim albumin poveča stabilnost encimskih skupkov, medtem ko PEHA poveča število prostih amino skupin (-NH2) na zunanji površini encima HRP, kar poenostavi postopek zamreženja encimskih delcev z mrežnim povezovalcem.
Ključne besede: imobilizacija biokatalizatorja, encimski nosilci, nanostrukturirani materiali, magnetni nanodelci, površinska funkcionalizacija, zamreženi encimski skupki, stabilizacija biokatalizatorja, holesterol oksidaza, hrenova peroksidaza
Objavljeno v DKUM: 04.05.2011; Ogledov: 4637; Prenosov: 486
Celotno besedilo (5,98 MB)

Ključne besede: flavinski encimi, Holesterol oksidaza, mutanti Arg477, optimizacija ekspresijskih pogojev, proizvodnja v večjem merilu
Objavljeno v DKUM: 26.07.2007; Ogledov: 4542; Prenosov: 0