1. Encimska razgradnja antibiotika z uporabo imobilizirane lakaze : diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnjeLuna Petrovič, 2022, undergraduate thesis Abstract: Namen diplomskega dela je bil izvedba študije učinkovitosti razgradnje antibiotika ciprofloksacina (CIP) s pomočjo imobiliziranega encima lakaze na magnetne nanodelce (MNPs). V prvem delu smo s koprecipitacijo Fe2+ in Fe3+ ionov pripravili funkcionalizirane MNPs, ki smo jih na začetku prevlekli s plastjo citronske kisline, da smo s tem preprečili aglomeracijo delcev. Za tem smo jih prevlekli še z natrijevim silikatom in funkcionalizirali z aminosilanom, s čimer smo omogočili nadaljnjo vezavo encima. V drugem delu smo MNPs aktivirali z zamreževalnim reagentom glutaraldehidom (GA) in nanje imobilizirali lakazo. Z imobilizacijo smo encimu povečali stabilnost, kar je omogočilo tudi njegovo večkratno uporabo.
Nadalje smo proučevali učinkovitost imobilizacije lakaze na visoko funkcionalizirane MNPs ter aktivnost imobiliziranega encima, pri čemer smo optimirali koncentracijo dodanega encima, čas imobilizacije, čas aktivacije z GA in volumen dodanega GA. S tako imobiliziranim aktivnim encimom smo nato izvedli reakcijo razgradnje CIP-a. Za namen boljše razgradnje CIP-a smo imobilizirani lakazi dodali mediator siringaldehid (SA), ki v veliki meri pripomore k povišanju aktivnosti lakaze. Prav tako smo proučili še vpliv temperature na stabilnost imobilizirane lakaze na MNPs ter določili kinetiko reakcije, pri čemer smo spreminjali koncentracijo substrata (CIP).
Na pripravljene MNPs nam je uspelo imobilizirati več kot 95 % encima in pri tem ohraniti 77 % njegove aktivnosti. Z imobiliziranim encimom smo po 24 h pri 25 °C dosegli 88,3 %, pri 30 °C 82,9 %, pri 40 °C pa 75,0 % razgradnjo CIP-a v raztopini s koncentracijo CIP-a 30 mg/L. Ugotovili smo, da se z višanjem temperature razgradnja CIP-a slabša. Postopek razgradnje CIP-a smo izvedli tudi pri treh različnih koncentracijah raztopine CIP-a, pripravljene s fosfatnim pufrom, in sicer 0,01 mg/mL, 0,03 mg/mL ter 0,05 mg/mL. Pri višji koncentraciji substrata smo zaznali višjo stopnjo razgradnje CIP-a. Določili smo tudi K_M in v_max za imobilizirano in prosto lakazo. K_M za imobilizirano lakazo je znašal 44 mg/L, v_max pa 0,11 mg/L min, medtem ko je K_M za prosto lakazo znašal 150 mg/L, v_max pa 0,98 mg/L min. Keywords: lakaza, MNPs, imobilizacija encima, aktivnost encima, glutaraldehid, ciprofloksacin, siringaldehid, razgradnja, HPLC Published in DKUM: 13.09.2022; Views: 617; Downloads: 102
Full text (3,40 MB) |
2. Sinteza s siliko funkcionaliziranih magnetnih nanodelcev za imobilizacijo proteinov : magistrsko deloAljaž Degen, 2021, master's thesis Abstract: Pri tem magistrskem delu smo pripravljali funkcionalizirane magnetitne (Fe3O4) nanodelce, ki bi lahko bili uporabljeni za imobilizacijo encimov tekom procesa čiščenja odpadne vode. Sintetizirane magnetitne nanodelce smo najprej funkcionalizirali s silikatno prevleko (SiO2) in (3-aminopropil) trietoksisilanom (APTES), na koncu je sledila še aktivacija z glutaraldehidom.
Za karakterizacijo sintetiziranih magnetitnih nanodelcev in njihovih derivatov smo uporabili več različnih metod. Sestavo magnetitnih nanodelcev smo določali z rentgensko praškovno difrakcijo (RTG); za določitev čistosti pripravljenih nanodelcev in vsebnosti vlage na njihovi površini smo uporabili termogravimetrično analizo (TGA); velikost nanodelcev smo določili s pomočjo rentgenske praškovne difrakcije, z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS) in s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM); uspešno funkcionalizacijo derivatov magnetitnih nanodelcev smo določali z meritvami zeta potenciala, infrardečo spektroskopijo s Fourierjevo transformacijo (FTIR) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Tekom magistrskega dela smo preverjali tudi, ali je potrebno za vezavo APTES-a na magnetitne nanodelce uporabiti silikatno prevleko (posredna vezava), ali lahko dobimo zadovoljive rezultate brez njene uporabe (direktna vezava).
Uspeli smo uspešno sintetizirati in funkcionalizirati magnetitne nanodelce ustrezne velikosti s silikatno prevleko in APTES-om. Razlika med vzorcema, ki sta imela direktno in posredno vezan APTES, je minimalna, zato lahko korak funkcionalizacije nanodelcev s silikatno prevleko izpustimo. Uspela je tudi aktivacija nanodelcev z glutaraldehidom, torej so takšni nanodelci pripravljeni za imobilizacijo encimov. Keywords: Fe3O4 nanodelci, silikatna prevleka, (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES), glutaraldehid, imobilizacija encimov Published in DKUM: 01.06.2021; Views: 1247; Downloads: 140
Full text (1,48 MB) |
3. Vezava encimov na površinsko modificirane magnetne nosilce : doktorska disertacijaKatja Vasić, 2020, doctoral dissertation Abstract: Doktorska disertacija zajema dva dela, v prvem delu smo se osredotočili na sintezo magnetnega nosilca, modificiranega z organskim polimerom karboksimetil dekstranom (CMD). V sintezni postopek smo vpeljali tri različne koncentracije CMD (0,25 g/mL, 0,40 g/mL in 0,50 g/mL CMD) ter sintetizirali tri različne modificirane magnetne nanodelce (CMD1-MNPs, CMD2-MNPs in CMD3-MNPs). Sintetizirane CMD-MNPs smo okarakterizirali z različnimi analiznimi metodami: Fourier-transformirano infrardečo spektroskopijo (FT-IR), termogravimetrično analizo (TGA), vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM), energijsko disperzijsko spektroskopijo (EDS), transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), z meritvami dinamičnega sipanja svetlobe (DLS). Magnetne lastnosti smo določili z elektronsko paramagnetno resonanco (EPR) in vibracijskim magnetometrom (VSM). Uspešno smo sintetizirali magnetne nosilce CMD-MNPs z ozkimi porazdelitvami nanovelikosti od 27-30 nm. S FT-IR analizo smo določili prisotnost karboksilnih in hidroksilnih skupin na površini CMD-MNPs, kar potrjuje prisotnost polimerne prevleke CMD na sintetiziranih MNPs. Z meritvami EPR in VSM smo dokazali, da imajo sintetizirani CMD-MNPs magnetne lastnosti ter feromagnetni sistem. Določili smo inhibitorne lastnosti CMD-MNPs na rast dveh bakterijskih kultur. Inhibitorne učinke na rast testnih mikroorganizmov smo zaznali pri CMD3-MNPs, medtem ko ostali CMD-MNPs in neprevlečeni MNPs ne izkazujejo antimikrobne učinkovitosti. Proučevali smo tudi inhibitorne lastnosti MNPs modificiranih s hitozanom (HIT-MNPs) in aminosilanom (AMS-MNPs) na petih različnih bakterijskih kulturah, pri katerih nismo zaznali inhibiornega učinka na rast izbranih mikororganizmov. Za nadaljnje raziskave smo izbrali CMD3-MNPs, na katerega smo vezali encim alkohol dehidrogenazo (ADH).
V drugem delu doktorske disertacije smo nosilec CMD3-MNPs površinsko funkcionalizirali z epiklorohidrinom (EClH). Optimalna koncentracija EClH je znašala 4 % (v/v). Proučevali smo vpliv različnih procesnih parametrov na preostalo aktivnost in učinkovitost imobilizacije ADH na CMD3-MNPs. Pri optimalnih pogojih imobilizacije ADH na CMD3-MNPs smo dosegli 89,6 % preostalo aktivnost imobilizirane ADH in 99,5 % učinkovitost imobilizacije. Nadaljevali smo s postopkom koimobilizacije, pri čemer smo na funkcionaliziran nosilec CMD3-MNPs koimobilizirali encim ADH in kofaktor β-nikotinamid adenin dinukleotid (β-NAD). S spreminjanjem procesnih parametrov smo proučevali njihov vpliv na preostalo aktivnost imobilizirane ADH s kofaktorjem β-NAD na CMD3-MNPs in učinkovitost koimobilizacije. Pri optimalnih pogojih koimobilizacije ADH in β-NAD na CMD3-MNPs smo dosegli 73,3 % preostalo aktivnost ADH ter 93,8 % učinkovitost imobilizacije.
Izvedli smo še študijo termične stabilnosti proste ADH, ADH imobilizirane na CMD3-MNPs in ADH koimobilizirane z β-NAD na CMD3-MNPs pri različnih temperaturah. ADH imobilizirana na CMD3-MNPs je ohranila skoraj 60 % svoje začetne aktivnosti po 24. urah inkubacije pri temperaturah 20 °C in 40 °C. ADH koimobilizirana z β-NAD na CMD3-MNPs je pri temperaturi 30 °C ohranila 75,4 % začetne aktivnosti, pri 50 °C pa 66,5 % začetne aktivnosti po 5. urah inkubacije. Proučili smo še stabilnost ADH imobilizirane na CMD3-MNPs in ADH koimobilizirane z β-NAD na CMD3-MNPs, ki smo ju skladiščili pri 4 °C. Po treh tednih sta obe obliki imobilizrane ADH ohranili 60 % svoje začetne aktivnosti. Magnetne nosilce HIT-MNPs in AMS-MNPs smo funkcionalizirali z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA) in amino-donorjem pentaetilenheksaminom (PEHA), na katere smo imobilizirali encim β-galaktozidazo (β-GAL) ter optimirali koncentraciji GA in PEHA. Pri kombinaciji obeh GA in PEHA smo dosegli hiperaktivacijo encima (128,9 %), do katere pride zaradi konformacijskih sprememb encima. Hiperaktivacijo smo dosegli tudi pri imobilizaciji β-GAL na AMS-MNPs. Najvišjo preostalo aktivnost β-GAL smo dosegli, kadar smo kot mrežni povezovalec uporabili 20 % (v/v) PEHA (154,4 %). Keywords: magnetni nanodelci, karboksimetil dekstran, karakterizacijska analiza, funkcionalizacija, epoksi zamreževanje, epiklorohidrin, glutaraldehid, encimi, imobilizacija, koimobilizacija, β-nikotinamid adenin dinukleotid, alkohol dehidrogenaza, β-galaktozidaza, kinetični parametri Published in DKUM: 13.05.2020; Views: 1974; Downloads: 336
Full text (9,26 MB) |
4. Aktivnost lakaze in celulaze v glivi Pleurotus ostreatusMihaela Taljan, 2018, undergraduate thesis Abstract: Diplomsko delo opisuje gojenje glive Pleurotus ostreatus (P. ostreatus) na trdnem gojišču ob uporabi ustreznega rastnega substrata. Opazovali smo prirast glive in merili njegovo maso v odvisnosti od časa inkubacije.
Po določenem časovnem obdobju smo izvedli ekstrakcijo encimov ter določili aktivnosti encima lakaze in celulaze v teh vzorcih. Zanimal nas je vpliv časa inkubacije na aktivnosti encimov. Prav tako smo določali aktivnost encimov iz zamrznjenih encimskih ekstraktov, saj smo želeli ugotoviti, kako se spremeni aktivnost encima, če ustvarimo mešanico koncentriranega encimskega ekstrakta.
Diplomsko delo prav tako opisuje zamreženje encimskih skupkov (CLEAs) iz encimskih ekstraktov. Ta postopek smo izvedli po določenem protokolu z uporabo različnih obarjalnih reagentov (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol) in z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA). Zamreženim encimskim skupkom smo določili učinkovitost imobilizacije, preostalo aktivnost in preostalo specifično aktivnost. Z namenom, da bi dosegli boljše rezultate, smo spremenili volumske deleže mrežnega povezovalca GA, obarjali pa smo le v acetonu, ker se je izkazalo, da je obarjanje encimskega preparata bilo najuspešnejše z njegovo uporabo. Zamreževanje je potekalo 3 ure na sobni temperaturi. Keywords: Pleurotus ostreatus, lakaza, celulaza, aktivnost, imobilizacija, glutaraldehid Published in DKUM: 23.07.2018; Views: 1497; Downloads: 175
Full text (4,36 MB) |
5. Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov (cleas) iz transglutaminazeNatalija Büdefeld, 2017, undergraduate thesis Abstract: Namen diplomskega dela je bil doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in čim višjo preostalo aktivnost imobiliziranega encima transglutaminaze (TG) z optimiranjem parametrov pri pripravi zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) in pripravi magnetnih zamreženih encimskih skupkov (mCLEAs).
Encim TG je služil za pripravo CLEAs in mCLEAs, ki smo ju izvedli vzporedno, ter tako pripravljenim vzorcem spreminjali parametre, ki so vplivali na stabilnost, učinkovitost in aktivnost imobiliziranih skupkov.
Proučevali smo vpliv obarjalnih reagentov, vpliv koncentracije glutaraladehida (GA), mrežnih povezovalcev, temperaturo zamreževanja, vpliv podaljšanega časa zamreževanja, vpliv koncentracije encima in vpliv koncentracije natrijevega cianoborohidrida na aktivnost in stabilnost imobiliziranega encima.
Rezultati prikazujejo, da je bila aktivnost CLEAs najvišja, ko smo obarjali encim TG s koncentracijo 100 mg/ml v obarjalnem reagentu 2-propanolu ob dodatku 10 % (v/v) mrežnega povezovalca GA in 200 µl natrijevega cianoborohidrida. Ugotovili smo tudi, da je bila dosežena najboljša aktivnost, z enakim obarjalnim reagentom in enako količino mrežnega povezovalca GA, kot smo ju uporabili pri CLEAs, mCLEAs z koncentracijo encima TG 200 mg/ml in 150 µl natrijevega cianoborohidrida. Keywords: glutaraldehid, obarjanje, transglutaminaza, zamreženi encimski skupki, magnetni zamreženi encimski skupki Published in DKUM: 22.11.2017; Views: 1407; Downloads: 150
Full text (4,07 MB) |
6. Imobilizacija lakaze v zamrežene encimske skupke (CLEAs)Mihaela Petek, 2017, undergraduate thesis Abstract: Diplomsko delo opisuje sintezo zamreženih encimskih skupkov iz encima lakaze (CLEAs). Sinteza CLEAs delcev iz lakaze je potekala po določenem postopku, pri katerem sta najpomembnejši fazi obarjanje in zamreženje. Raztopino encima lakaze smo obarjali v različnih obarjalnih reagentih, najuspešnejša sta bila obarjalna reagenta etanol, 1-propanol in 2-propanol. Oborjeni encim smo zamreževali z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom. Zamreženim encimskim skupkom smo določevali učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom.
Pri postopku imobilizacije smo z namenom, da bi dosegli čim višjo učinkovitost imobilizacije ter čim višjo preostalo aktivnost imobiliziranega encima, spreminjali parametre, kot so volumski deleži glutaraldehida, čas zamreženja, vpliv ogrodnih proteinov govejega seruma albumina (BSA) in jajčnega albumina (EA), volumski deleži natrijevega cianoborohidrida in temperaturo zamreženja. Vse vzorce smo tudi dvakrat spirali, z namenom da bi odstranili nezamrežen encim. Keywords: Lakaza, imobilizacija, zamreženi encimski skupki, obarjanje, zamreženje, glutaraldehid, encimska aktivnost Published in DKUM: 22.11.2017; Views: 1868; Downloads: 180
Full text (1,71 MB) |
7. Imobilizacija lakaze v magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEAs)Nina Šenekar, 2017, undergraduate thesis Abstract: Pripravili smo zamrežene magnetne encimske skupke (mCLEAs) iz lakaze. Metoda sestoji iz dveh delov: obarjanje encima z ustreznim obarjalnim reagentom in imobilizacija dobljenega agregata v zamrežene encimske skupke z zamreževalcem glutaraldehidom. S centrifugiranjem smo produkt ločili na pelet in supernatant. Supernatant smo uporabili za test koncentracije proteinov, na peletu pa smo izmerili preostalo aktivnost lakaze. Namen diplomske naloge je bil pripraviti mCLEAs z najvišjo preostalo aktivnostjo lakaze in učinkovitostjo imobilizacije.
Preizkušali smo vpliv naslednjih parametrov: koncentracija magnetnih nanodelcev, koncentracijo glutaraldehida, količina NaBH3CN, temperatura, čas ter koncentracija encima. Raztopini encima smo dodajali ogrodne proteine: albumin iz govejega seruma (BSA) ter albumin iz kokošjih jajc (EA).
mCLEAs z visoko preostalo aktivnostjo smo pripravili z uporabo 10 mg magnetnih nanodelcev v 100 µL raztopine lakaze koncentracije 20 mg/ml. Obarjali smo z 900 µL obarjalnega reagenta 2-propanol. Zamreževali smo z 15% (v/v) GA (150 µL) in dodali 50 µL NaBH3CN. Zamreževanje se je vršilo tri ure s hlajenjem. Keywords: lakaza, glutaraldehid, imobilizacija, magnetni nanodelci, magnetni zamreženi encimski skupki Published in DKUM: 19.09.2017; Views: 1381; Downloads: 130
Full text (1,45 MB) |
8. Sinteza zamreženih encimskih skupkov iz encima transglutaminazeŠpela Lesičar, 2017, undergraduate thesis Abstract: Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) iz encima transglutaminaze. Pri tem smo želeli doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost encima transglutaminaze. Sinteza je zajemala postopek obarjanja encima v izbranem obarjalnem reagentu in zamreženja encima z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA). Da bi dosegli čim boljše rezultate smo morali izbrati ustrezen obarjalni reagent ter njegovo količino. Optimirali smo parametre pri zamreženju, kot so koncentracija dodanega mrežnega povezovalca, koncentracija dodanega natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN), koncentracija ogrodnih proteinov govejega serumskega albumina (BSA) in jajčnega albumina (EA) ter koncentracija transglutaminaze.
Iz rezultatov smo ugotovili, da je 2-propanol najbolj ustrezen obarjalni reagent za sintezo CLEAs iz transglutaminaze. Optimalni volumski procent obarjalnega reagenta je bil 92,4 % (v/v), kar znaša 1215 μl. Za optimalne rezultate smo uporabili raztopino encima s koncentracijo 150 mg/ml s 100 mg/ml EA. Encimske molekule smo zamrežili z 2 % (v/v) GA ob 3 urnem mešanju. Za boljšo stabilnost encima smo dodali 200 μl 0,1 M NaBH3CN. Ugotovili smo, da lahko tako imobilizirano transglutaminazo kot katalizator reakcije uporabimo trikrat z aktivnostjo encima nad 100 % preden se deaktivira. Keywords: transglutaminaza, zamreženi encimski skupki, imobilizacija, mrežni povezovalec, glutaraldehid Published in DKUM: 18.09.2017; Views: 1479; Downloads: 116
Full text (1,88 MB) |
9. PRIDOBIVANJE MAGNETNIH ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV S PRECIPITACIJO Z ETANOLOMStaša Matis, 2015, undergraduate thesis Abstract: Diplomsko delo zajema pripravo magnetnih zamreženih encimskih skupkov (ali na kratko mCLEAs) iz encima celulaze. Naš namen je bil določiti optimalne pogoje za pripravo mCLEAs tako, da bosta učinkovitost in aktivnost imobilizacije zamreženih encimskih skupkov najvišja. V prvem delu diplomskega dela smo pripravili magnetne zamrežene encimske skupke s precipitacijo z etanolom. Pri tem smo spreminjali različne parametre (hitrost stresanja, čas stresanja, koncentracijo glutaraldehida in temperaturo), medtem ko je bil namen drugega dela diplomskega dela izpostavitev mCLEAs različnim temperaturam (23°C, 4°C, -15°C), ter ugotavljanje, kako se aktivnost mCLEAs pri različnih pogojih izpostavitve spreminja s časom.
Naši rezultati prikazujejo, da je bila aktivnost mCLEAs najvišja, ko smo si mCLEAs pripravili pri 10°C in uporabili 0,7 % koncetracijo glutaraldehida.
Pri izpostavitvi mCLEAs različnim temperaturam pa smo ugotovili, da aktivnost mCLEAs s časom najbolj upada kadar so bili mCLEAs izpostavljeni pri -15°C. Keywords: etanol, glutaraldehid, magnetni zamreženi encimski skupki, precipitacija, zamreženje Published in DKUM: 22.10.2015; Views: 1658; Downloads: 156
Full text (1,87 MB) |
10. MAGNETNI ZAMREŽENI ENCIMSKI SKUPKI IZ CELULAZESandra Mertik, 2015, undergraduate thesis Abstract: Diplomsko delo je sestavljeno iz dveh delov. Najprej smo sintetizirali magnetne zamrežene encimske skupke iz celulaze. Pri tem smo optimizirali parametre, kot so hitrost stresanja na stresalniku, koncentracijo mrežnega povezovalca glutaraldehida, čas stresanja in temperaturo, z namenom doseči čim večjo učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost imobilizirane celulaze. Postopek priprave magnetnih zamreženih skupkov sestoji iz dveh korakov, obarjanja in zamreženja. Kot obarjalni reagent smo uporabili metanol.
V drugem delu diplomske naloge, smo magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEAs) iz celulaze sintetizirali pri optimalnih pogojih in jih skladiščili pri 23°C. Zanimalo nas je, kako izbrana temperatura in čas skladiščenja vplivata na preostalo aktivnost mCLEAs. Proučevali smo tudi vpliv tlaka pri konstantni temperaturi na preostalo aktivnost mCLEAs. mCLEAs smo izpostavili superkritičnemu ogljikovemu dioksidu pri 100 bar in 200 bar pri različnih časih izpostavitve. Keywords: metanol, obarjanje, zamreženje, superkritični fluid, magnetni zamreženi encimski skupki, glutaraldehid Published in DKUM: 21.10.2015; Views: 2294; Downloads: 137
Full text (1,85 MB) |