Search the digital library catalog

Abstract: The lack of reliable biomarkers in response to anti-TNFα biologicals hinders personalized therapy for Crohn’s disease (CD) patients. The motivation behind our study is to shift the paradigm of anti-TNFα biomarker discovery toward specific immune cell sub-populations using single-cell RNA sequencing and an innovative approach designed to uncover PBMCs gene expression signals, which may be masked due to the treatment or ongoing inflammation; Methods: The singlecell RNA sequencing was performed on PBMC samples from CD patients either naïve to biological therapy, in remission while on adalimumab, or while on ustekinumab but previously non-responsive to adalimumab. Sieves for stringent downstream gene selection consisted of gene ontology and independent cohort genomic profiling. Replication and meta-analyses were performed using publicly available raw RNA sequencing files of sorted immune cells and an association analysis summary. Machine learning, Mendelian randomization, and oligogenic risk score methods were deployed to validate DEGs highly relevant to anti-TNFα therapy response; Results: This study found PLCB1 in CD4+ T cells and CRTAM in double-negative T cells, which met the stringent statistical thresholds throughout the analyses. An additional assessment proved causal inference of both genes in response to anti-TNFα therapy; Conclusions: This study, jointly with an innovative design, uncovered novel candidate genes in the anti-TNFα response landscape of CD, potentially obscured by therapy or inflammation.
Keywords: inflammatory bowel diseases, Crohn’s disease, tumor necrosis factor alpha, adalimumab, single-cell gene expression analysis
Published in DKUM: 10.12.2024; Views: 0; Downloads: 3
Full text (7,36 MB)
This document has many files! More...

Abstract: Parodontoza je pogosta vnetna bolezen, ki lahko vpliva na slabšo odzivanje bolnikov s sistemskimi boleznimi, kot je revmatoidni artritis, na biološko zdravilo adalimumab. Ugotovljeno je bilo, da stopnja revmatoidnega artritisa korelira z ravnijo izražanja MMD gena v makrofagih izoliranih iz sinovialne tekočine vnetih sklepov. Poleg tega stopnja izražanja MMD vpliva na klinični odziv bolnikov s kronično vnetno črevesno boleznijo na adalimumab. V magistrskem delu smo se odločili preveriti, kako se monociti in iz njih in vitro diferencirani makrofagi bolnikov s parodontozo odzivajo na biološko zdravilo adalimumab ter kakšno vlogo ima pri tem ekspresija MMD. Pri monocitih in iz njih diferenciranih makrofagih smo simulirali vnetje z dodatkom LPS in zdravljenje vnetja s komercialnim biološkim zdravilom adalimumab, ter preverili izražanje vnetnih genov IL1B, IL6 in TNFα. Adalimumab je učinkovito zavrl izražanje genov IL1B in IL6, ki v signalni kaskadi ležita nižje od TNFα, čeprav v primeru IL6 samo za monocite. Na izražanje TNFα dodatek adalimumaba ni imel vpliva. V magistrskem delu nismo dokazali vpliva MMD na učinkovitost adalimumaba pri zaviranju TNFα. Vendar zaradi teh ugotovitev ne moremo ovreči njegove potencialne vloge pri vplivu na učinkovitost adalimumaba, saj je potrebno izvesti še veliko raziskav s spremenjenimi eksperimentalnimi pogoji in tako potrditi ali ovreči vlogo MMD pri neučinkovitosti adalimumaba in s tem pripomoči k izboljšanju zdravljenja vnetnih bolezni.
Keywords: MMD, parodontoza, vnetni citokini, adalimumab, monociti, makrofagi, in vitro diferenciacija, in vitro vnetje, TNFα
Published in DKUM: 20.04.2023; Views: 588; Downloads: 75
Full text (2,80 MB)

Abstract: Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je dolgotrajno (kronično) obolenje črevesja, ki je imunsko pogojeno. Med KVČB uvrčamo dve bolezni, ki sta si precej podobni, to sta Crohnova bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK), v 10-15% pa bolezni ne moremo razvrstiti v prejšnji skupini, zato jo uvrščamo v intermediarni kolitis (KI) [1]. Vzroki za KVČB še niso dodobra pojasnjeni, vendar pa so odvisni od okoljskih in genetskih dejavnikov. KVČB uvrščamo med kompleksne kronične imunske bolezni, med katere sodijo tudi nekatera druga obolenja, kot so revmatoidni artritis, multipla skleroza itd. Bolezen KVČB zdravijo na več načinov, v današnjih časih pa dajejo velik poudarek na biološka zdravila, ki so večinoma zelo učinkovita, vendar pa pri nekaterih pacientih opažamo neodzivnost. V diplomskem delu smo se lotili analize ekspresijskih in epigenetskih profilov pri slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo na anti-TNF terapiji z adalimumabom (ADA). Cilj je bila identifikacija kandidatnih biooznačevalcev, ki bi predvideli bolnikovo odzivnost na tovrstno biološko zdravljenje. Odločili smo se za testiranje gena AXIN1. V študiji pri bolnikih z revmatoidnim artritisom, ki je tako kot KVČB kronična vnetna avtoimuna bolezen, je bila namreč dokazana različna stopnja metiliranosti tega gena pri odzivnikih in neodzivnikih na adalimumab [2]. Tako kot pri KVČB, tudi pri RA uporabljajo biološke terapije in pri obeh je približno 20-40 % neodzivnikov na tako terapijo [3], [4]. Ugotovili smo, da je pri bolnikih s KVČB statistično značilno povečanje izražanje gena za AXIN1 v primerjavi z zdravimi kontrolami, vendar je razlika zelo majhna, med odzivniki in neodzivnki pa ni bilo opaziti razlik. Za namen epigenetskih študij smo pripravili različne metilacijske kontrole in poskusili optimizirati metilacijske teste. Ker naše epigenetske analize niso dale jasnih končnih rezultatov, bodo potrebne nadaljnje preiskave.
Keywords: KVČB, adalimumab, odzivniki, neodzivniki, AXIN1, genska ekspresija, metilacija
Published in DKUM: 26.04.2018; Views: 2466; Downloads: 134
Full text (2,21 MB)

Abstract: Faktor tumorske nekroze alfa (TNFα) je glavni provnetni citokin, ki je vključen v imunski odgovor pri Crohnovi bolezni (CB). Za zdravljenje CB se v primerih, ko standardna terapija s kortikosteroidi in antibiotiki ni uspešna, uporabljajo zdravila, ki delujejo proti citokinu TNFα (antiTNF), kot sta infliksimab (IFX) in adalimumab (ADA), vendar pa se približno tretjina bolnikov na takšno terapijo ne odziva. Cilj magistrskega dela je bil ugotoviti, ali izražanje genov TNFAIP6, S100A8, IL11, G0S2 in S100A9 v krvnih limfocitih in črevesni sluznici slovenskih bolnikov s CB vpliva na odziv na terapijo z ADA in ali je možno z izbranimi geni napovedati odziv na zdravljenje, kar bi lahko bil korak naprej k personaliziranemu zdravljenju CB. Izražanje izbranih genov smo izmerili z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (rt-PCR) pred terapijo in v 4., 12., 20. in 30. tednu terapije. Genotipe za izbrane polimorfizme smo pridobili iz mikromreže »Immunochip«. Odziv na terapijo smo ocenili s pomočjo IBDQ vprašalnika in nivoja CRP v krvi. Za statistično obdelavo smo uporabili statistični paket SPSS. Ugotovili smo signifikantno spremenjeno izražanje gena S100A8 pri primerjavi izražanja gena pred terapijo z izražanjem v 4. (p = 5×10-5, Z = -3,975) in 12. tednu (p=0,050). Signifikantno povišano ekspresijo gena S100A9 smo ugotovili po štirih tednih zdravljenja (p = 0,012). Pri primerjavi izražanja genov pred terapijo in v posameznih tednih med terapijo pri istem bolniku smo ugotovili dve signifikantni povezavi v okviru 95 % intervala zaupanja. Za gen S100A8 smo po 4 tednih terapije ugotovili signifikantno višje izražanje tega gena, saj je razlika median 2-ddct znašala 0,519 (p = 0,009), po 20. tednih zdravljenja z ADA pa smo ugotovili signifikantno nižje izražanje gena S100A9 (p = 0,045). Na podlagi IBDQ vprašalnika in izmerjene ekspresije izbranih genov smo ugotovili povečano ekspresijo gena G0S2 po 30. tednih zdravljenja z ADA (p = < 1×10-8, Z = -5,745), signifikantno nižje pa je bilo tudi izražanje gena TNFAIP6 pri dobrih odzivnikih na terapijo po 20. tednih terapije. Glede na kriterij CRP smo ugotovili signifikantno višjo ekspresijo gena G0S2 po 20. tednih terapije z ADA pri dobrih odzivnikih (p = 0,022). Ugotovili smo, da so proučevani geni in SNP-ji povezani z odzivom na ADA pri bolnikih s CB in nedvoumno predstavljajo dobre kandidate za potencialne napovedovalce odziva na zdravljenje CB z ADA. V prihodnosti je potrebno identificirati še večje število genov za napoved odziva in jih združiti v ustrezen napovedni model.
Keywords: Crohnova bolezen, adalimumab, antiTNF, genska ekspresija, napoved odziva, biološka zdravila
Published in DKUM: 05.09.2016; Views: 2097; Downloads: 161
Full text (3,27 MB)

Abstract: Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je kompleksna bolezen in se pojavlja v dveh podtipih, kot Crohnova bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK). CB lahko prizadene celoten prebavni trakt, medtem ko UC prizadene skoraj izključno danko in debelo črevo. Na potek in razvoj bolezni pomembno vplivajo tako okoljski dejavniki kot tudi genetska zasnova posameznika. Asociacijske študije na celotnem genomu (GWA študije) so do danes identificirale 163 lokusov na človeškem genomu, ki so povezani z nastankom KVČB. Zdravljenje KVČB poteka v več stopnjah. Navadno začnemo z aminosalicilati, nadaljujemo s kortikosteroidi in imunosupresivi. Če zdravljenje s standardno terapijo ni uspešno, pa si v zadnjem času pomagamo z biološkimi zdravili in sicer zaviralci provnetnega citokina TNF-α, katerih prva predstavnika sta infliksimab (IFX) in adalimumab (ADA). Terapija z zaviralci TNF-α je naredila izjemen napredek v zdravljenju ne samo CB, ampak tudi ostalih oblik KVČB. V naši študiji smo se osredotočili na zdravljenje bolnikov s CB z adalimumabom (ADA). ADA je humano monoklonsko protitelo. Z odmerjanjem vsaki drugi teden dosegamo zelo dober odziv, v indukcijski kot tudi vzdrževalni terapiji, z zelo solidnim procentom bolnikov v remisiji, vendar se kljub temu približno tretjina bolnikov ne odziva na terapijo z zaviralci TNF-α. Cilj naloge je bil izvesti prospektivno farmakogenetsko raziskavo, pri čemer bi odkrili genetske biooznačevalce, s katerimi bi lahko vnaprej napovedali, kakšen bo izid zdravljenja z ADA pri posameznem bolniku. Dodatno smo želeli ugotoviti ali obstaja povezava med odzivom na terapijo z ADA in izražanjem genov pri bolnikih s CB, pri čemer smo ugotovili, da prav tako izstopa gen ATG16L1, pri katerem se je izražanje statistično značilno spreminjalo skozi celotno obdobje zdravljenja. Prav tako smo v nalogi analizirali potencialne povezave med imunološkimi, biokemijskimi in hematološkimi parametri. V študijo smo zajeli 102 bolnika s CB. Bolnike smo spremljali tako, da smo jim pred terapijo ter po 4., 12., 20., in 30. tednu odvzeli kri, izmerili vrednost C-reaktivnega proteina (CRP) kot pokazatelja vnetja ter ovrednotili uspešnost zdravljenja z IBDQ vprašalnikom, ki poleg vprašanj kliničnega značaja zelo dobro odraža psihološko stanje in počutje bolnika. Glede na število točk IBDQ vprašalnika smo ovrednotili uspešnost terapije, tako da je število nad 170 ali relativni dvig IBDQ za 22 točk pomenilo remisijo. Uspešnost terapije smo ovrednotili tudi z vrednostjo CRP in sicer smo menili, da je terapija uspešna, v kolikor se je CRP zmanjšal za 25% glede na začetno stanje pred zdravljenjem oz. je CRP dosegel normalne vrednosti. DNA polimorfizme posameznega nukleotida (SNP) in kandidatne gene smo izbrali po sledečih kriterijih: SNP-ji, močno povezani s KVČB v posameznih kandidatnih študijah, SNP-ji, ki so jih potrdile GWA študije za KVČB, ter SNP-ji, ki so bili v predhodnih študijah povezani z odzivom na IFX. Skupno smo genotipizirali 33 izbranih SNP-jev in izmerili izražanje 5 genov, predhodno povezanih s KVČB ter primerjali genotipe izbranih SNP-jev in nivo izražanja genov z odzivom na zdravljenje z ADA. Gensko tipizacijo polimorfizmov SNP v izbranih genih/lokusih smo izvajali z metodo analize talilnih krivulj visoke ločljivosti (HRM, ang. high resolution melting) in tehniko polimorfizmov dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism). Ugotovili smo, da je bil pozitivni odziv na zdravljenje z ADA merjen z IBDQ po 4 tednih pri 62.9% bolnikov, po 12 tednih 68%, po 20 tednih 66% in po 30 tednih 71%. V primeru merjenja odziva z CRP pa je imelo po 4 tednih pozitivni odziv 82,6% bolnikov, po 12 tednih 71,9% , po 20 tednih 72,7% in po 30 tednih 72,5% bolnikov. Najmočnejšo povezavo smo našli med polimorfizmom SNP rs10210302 v genu ATG16L1 in biološkim odgovorom na terapijo z ADA, merjenim s CRP, pri čemer so imeli bolniki z genotipom TT boljši odgovor po 12, 20 in 30 tednih zdravljenja v primerjavi z bolniki z genotipom CC (p=8.11E-04, p (po korekciji za multiplo testiranje = 0,027)). Nadalje smo močno povezavo odkrili med polimorfizmom SNP rs10512734, ki je lociran v genski puščavi na kromosomu 5p13.1 in za katerega je bilo dokazano, da vpliva na izražanje gena PTGER4 ter odgovorom na ADA, pri čemer so imeli bolniki z genotipom GG boljši odgovor v primerjavi z bolniki z genotipom AA po 12 tednih zdravljenja (p=4.62E-03). Ostale statistično najbolj značilne povezave smo ugotovili med SNP-ji v genih CASP9, IL27, CCNY, C11orf30, NR1I2 in IL13 ter odzivom na zdravljenje z ADA. V skladu s predhodnimi kliničnimi študijami smo tudi v naši študiji potrdili povezavo med nekaterimi kliničnimi značilnostmi bolnikov in odzivom na zdravljenje. Bolniki, ki predhodno še niso bili zdravljeni z IFX, so se signifikantno boljše odzvali na terapijo. Glede vzporedne terapije s standardnimi zdravili nismo našli značilnih povezav z odzivom na zdravljenje. Boljši odziv na zdravljenje smo opazili pri bolnikih, ki so bili predhodno kirurško zdravljeni. In boljši odziv na terapijo je bil opažen tudi pri nekadilcih. Bolniki, ki so bili ob postavitvi diagnoze mlajši, so se na terapijo boljše odzivali. Rezultati naše študije kažejo, da je odziv na zdravljenje z ADA deloma genetsko pogojen s polimorfizmi SNP, povezanimi z nastankom CB, pri čemer se je kot najbolj obetaven kandidatni gen za odgovor na zdravljenje z ADA izkazal gen ATG16L1. Glede na to, da smo našli številne povezave z drugimi polimorfizmi SNP ter odgovorom na ADA, bodo v prihodnje potrebne nadaljnje farmakogenetske študije, ki bi te povezave potrdile na večjem številu bolnikov s CB s ciljem razviti molekularne biološke označevalce in napovedne modele, s katerimi bi lahko načrtovali individualizirano zdravljenje bolnikov.
Keywords: kronična vnetna črevesna bolezen, Crohnova bolezen, polimorfizem posameznega nukleotida, adalimumab, farmakogenomika, biooznačevalci
Published in DKUM: 16.07.2015; Views: 2677; Downloads: 348
Full text (4,76 MB)