1. Proteomska analiza mononuklearnih celic periferne krvi pri raku dojk : magistrsko deloDea Simonič, 2023, master's thesis Abstract: Rak dojk je najpogostejši rak pri ženskah in obenem najpogostejši vzrok smrti zaradi raka pri ženski populaciji. Rak te vrste za uspešno napredovanje in metastaziranje preoblikuje okoliško tkivo in ustvari lastno tumorsko mikrookolje. Slednje med drugim vključuje spremembe v celicah imunskega sistema, katerega ključna komponenta za boj proti infekcijam in prilagajanje patogenom so mononuklearne celice periferne krvi (MCPK). Posledično proteini MCPK lahko predstavljajo pomembne biomarkerje imunskih bolezni, med drugim tudi rakavih obolenj, saj je znano, da se ob nastanku raka spremeni proteom MCPK. Med naborom tehnik, s katerimi je mogoče v velikem obsegu raziskovati proteine, je zaradi svoje sposobnosti obvladovanja proteomske kompleksnosti postala razširjena tekočinska kromatografija, sklopljena s tandemsko masno spektrometrijo (LC MS/MS).
V magistrski nalogi smo optimizirali metodo izolacije in priprave proteinskih vzorcev iz MCPK, ki je preprosta, učinkovita in neposredno združljiva s sistemom LC-MS/MS. Učinek optimizacije smo ocenili na podlagi števila identificiranih peptidov in proteinskih skupin v vsakem vzorcu ter na podlagi ponovljivosti metode. Najprej smo preizkusili različne sestave liznih pufrov za izolacijo proteinov in ugotovili, da je najbolj obetaven lizni pufer MSC RIPA na osnovi natrijevega deoksiholata in etilen glikola. Ker sprememba koncentracij površinsko aktivnih snovi v MSC-RIPA pufru ni pokazala izboljšanja pri identifikaciji proteinov z masnim spektrometrom, smo v protokol dodali korak frakcionacije peptidov z močno kationsko izmenjavo na različno število frakcij. Za možnost analize večjega števila vzorcev v istem času smo optimizirali tudi trajanje kromatografske metode na LC MS/MS instrumentu.
Končna optimizirana metoda obsega lizo MCPK z MSC-RIPA pufrom, SCX frakcionacijo vzorcev na tri frakcije ter analizo na LC-MS/MS z 75-minutnim kromatografskim gradientom. Z optimizirano metodo smo dosegli povprečno 3 373 (s.d. ± 52) identificiranih proteinskih skupin na vzorec MCPK z metodo, ki omogoča analizo 21 vzorcev na teden. Optimizirana metoda nam je omogočila izvedbo preliminarne proteomske študije na šestih vzorcih MCPK bolnic z rakom dojk – dosegli smo povprečno 3 370 (s.d. ± 99) identificiranih proteinskih skupin na vzorec. Te smo primerjali s tremi vzorci MCPK zdravih posameznikov in izvedli analizo diferencialne ekspresije. Na podlagi opravljane analize diferencialne ekspresije na vzorcih treh kontrol, treh vzorcih bolnic z luminalnim podtipom A ter treh vzorcih bolnic z luminalnim podtipom B, smo identificirali tri proteine, ki so bolj izraženi v vzorcih MCPK bolnic z rakom dojk in bi lahko bili potencialni biomarkerji raka dojk iz periferne venske krvi.
Tako optimizirana metoda bo uporabljena za študijo proteoma MCPK na večji kohorti bolnic z rakom dojk, seveda pa jo je mogoče uporabiti tudi za preučevanje drugih bolezni.
Keywords: proteomska analiza, MCPK, masna spektrometrija, rak dojk
Published in DKUM: 25.09.2023; Views: 470; Downloads: 85
 Full text (23,88 MB) |
2. |
3. Analiza fenotipskih, molekularnih in genetskih lastnosti nove celične linije trojno negativnega raka dojkKristijan Skok, 2022, doctoral dissertation Abstract: Rak dojk je najpogostejši rak na svetu. Eden izmed njegovih podtipov je trojno negativni rak dojk (TNRD), za katerega je značilen agresiven potek, slabša prognoza in heterogenost. V svoji doktorski nalogi predstavim novo izolirano celično linijo TNRD, poimenovano MFUM-BrTNBC1. Linija je bila celovito karakterizirana (morfološko, fenotipsko, genotipsko). Za kontrole so služile komercialne celične linije z različnimi receptorskimi profili (MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-453). Primerjalne morfološke analize so bile opravljene s pomočjo mikroskopije ter biomedicinske slikovne analize. S pomočjo imunocito/histokemičnih barvanj je bila preverjena izraženost hormonskih receptorjev (estrogen, progesteron), HER2, p53 in Ki-67 statusa. Ekspresija receptorjev je bila dodatno preverjena na transkripcijski ravni s qRT-PCR metodo. Dodatno je bilo opravljeno RNA sekvenciranje za molekularno analizo. Avtentičnost celičnih linij je bila preverjena s pomočjo STR profiliranja. MFUM-BrTNBC-1 celična linija je ohranila trojno negativni receptorski status in genetsko stabilnost do vsaj 6. pasaže. Rezultati STR analize in navzkrižna preverba z mednarodnimi bazami so dokazali avtentičnost celične linije. MFUM-BrTNBC1 se je po morfologiji celic razlikovala tudi od TNRD celične linije MDA-MB-231. Razlike od komercialne linije, predstavljajo tudi glavne prednostne lasnosti MFUM-BrTNBC-1. Te so izolacija iz primarnega tumorskega tkiva, popoln izvorni zapis, mednarodno poimenovanje, celoten in edinstven STR profil ter genetska stabilnost do vsaj 6. pasaže.
Keywords: trojno negativni rak dojk, MFUM-BrTNBC-1, rak dojk, in-vitro modeli, celične linije
Published in DKUM: 29.11.2022; Views: 823; Downloads: 70
Full text (6,85 MB) |
4. Izražanja skupine genov DNA-metiltransferaz (DNMT1, DNMT3A in DNMT3B), DNA-demetilaz (TET1, TET2, TET3 in TDG) ter gena RNA-metiltransferaza TRDMT1 v tumorjih bolnic z rakom dojk : magistrsko deloNastja Šadl, 2022, master's thesis Abstract: DNA-metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B, DNA-demetilaze TET1, TET2, TET3 in TDG ter RNA-metiltransferaza TRDMT1 imajo pomembno vlogo pri uravnavanju metilacije genoma in genskih prepisov, s čimer uravnavajo izražanje genov. Spremenjeno izražanje omenjenih encimov povezujemo z nastankom in razvojem različnih vrst rakov, med drugim tudi raka dojk. Mehanizmi njihovega delovanja so v literaturi dobro opisani, medtem ko njihova patofiziološka vloga pri nastanku in razvoju raka dojk ni povsem znana. Namen magistrskega dela je bil raziskati izražanje DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3, TGD in TRDMT1 na parnih vzorcih zdravega in bolnega tkiva 17 bolnic z rakom dojk ter v povezavi z gradusom in izražanostjo progesteronskih receptorjev pri raku dojk. Povišano izražanje v tumorskem tkivu v primerjavi z zdravim okolnim tkivom smo ugotovili pri DNMT1 (p<0,01), DNMT3A (p<0,05), DNMT3B (p<0,01), TET2 (p<0,05) in TET3 (p<0,01), medtem kot se izražaje TET1 ni razlikovalo med zdravim in tumorskim tkivom. Izražanje TDG in TRDMT1 je bilo višje v tumorskem kot zdravem tkivu, vendar razlika ni dosegla statistične značilnosti. Za tumorsko tkivo je bilo statistično značilno višje izražanje DNMT1 (p<0,001) in DNMT3A (p<0,001) v primerjavi z DNMT3B in statistično značilno višje izražanje TDG v primerjavi s TET1 (p<0,05) in TET3 (p<0,01). Razlik v izražanji med DNMT1 in DNMT3A ter TET1, TET2 in TET3 v tumorskem tkivu nismo ugotovili. Primerjava izražanja vseh genov med seboj je v tumorskem tkivu pokazala na statistično značilno i) višje izražanje TDG v primerjavi z ostalimi proučevanimi geni, ii) višje izražanje DNMT1 v primerjavi s TET1 (p<0,01) in TRDMT1 (p<0,05), iii) nižje izražanje DNMT3B v primerjavi s TET1 (p<0,05) in TRDMT1 (p<0,05) in iv) nižje izražanje TET3 od TET1 (p<0,05) in TRDMT1 (p<0,05). Omenjenih razlik v zdravem tkivu nismo ugotovili. Izraženost progesteronskih receptorjev in gradus tumorja nista vplivala na izražanje proučevaih genov. Post hoc analiza je pokazala na statistično značilno i) višje (p<0,05) izražanje DNMT1 v bolnem tkivu pri rakih tretjega gradusa v primerjavi z izražanjem DNMT1 v zdravem tkivu pri rakih drugega gradusa, ii) višje (p<0,05) izražanje TDG pri rakih dojk drugega kot tretjega gradusa in iii) višje izražanje TDG v tumorskem tkivu v primerjavi z izražanjem TET1 (p<0,05), TET2 (p<0,05) in TET3 (p<0,05) v zdravem tkivu ter TET3 v tumorskem tkivu (p<0,05) pri rakih drugega gradusa.
Naša raziskava kaže na specifično povišano izražanje DNA-metiltransferaz DNMT1, DNMT3A in DNMT3B, DNA-demetilaz TET1, TET2, TET3 in TDG in RNA-metiltransferaze TRDMT1 pri raku dojk. V nadaljevanju bo za boljše razumevanje vloge metilacije pri tumorigenezi raka dojk potrebno rezultate izražanja posameznih metiltransferaz in demetilaz povezati z globalnimi študijami metiloma.
Keywords: DNA-metiltransferza, DNA-demetilaza, TRDMT1, rak dojk, RT-qPCR
Published in DKUM: 27.09.2022; Views: 579; Downloads: 43
Full text (3,63 MB) |
5. Validacija klinično pomembnih transkripcijskih biooznačevalcev v krvnih vzorcih pred in po zdravljenju trojno negativnega raka dojke : magistrsko deloAnja Konajzler, 2022, master's thesis Abstract: Rak dojke (RD) je najpogostejši rak pri ženskah in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka pri ženskah. Gre za maligno obolenje, ki izvira iz tkiva dojke, najpogosteje iz notranje obloge mlečnih vodov ali režnjev, ki vode oskrbujejo z mlekom. Eden izmed podtipov raka dojke je trojno negativni rak dojke (TNRD), za katerega je značilno, da nima ekspresije ER in PR in nima amplifikacije HER2, ter da je zelo invaziven in povezan s slabo prognozo in visoko umrljivostjo. Spremenjeno izražanje genov CXCR4, THBS1 in miR-137 so predhodno povezali s TNRD. Namen naše študije je bil testirati in validirati njihovo uporabnost kot potencialni krvni biomarkerji za trojno negativni rak dojke. V primerjavi s tkivnimi označevalci imajo krvni biološki označevalci pomembno prednost, da so manj invazivni. Iz 210 vzorcev mononuklearnih celic periferne krvi (PBMC) odvzetih bolnicam z rakom dojke pred zdravljenjem, 28 vzorcev plazme (13 pred zdravljenjem, 15 po zdravljenju) ter 25 vzorcev krvnih PBMC zdravih kontrol smo izolirali RNA za analizo izražanja genov z metodo RT-qPCR. Plazemski vzorci pred in po zdravljenju TNRD so bili zanimivi s stališča spremljanja terapije.
Analiza izražanja CXCR4 v imunskih celicah PBMC je pri pacientkah z rakom dojke pred terapijo odkrila zanimive rezultate. Izražanje CXCR4 je bilo značilno povišano pri tistih bolnicah, ki so imele invazivni duktalni karcinom (IDC), v primerjavi s tistimi, ki so imele invazivni lobularni karcinom (ILC). To nakazuje na potencialno uporabnost merjenja izražanja CXCR4 v krvi kot označevalca za IDC. Ugotovili smo tudi, da imajo pacientke, pri katerih rakave celice izražajo PR, značilno povečano izražanje CXCR4 v krvnih imunskih celicah. Teh izsledkov nismo zasledili v objavljeni literaturi in predstavljajo nove ugotovitve pri raku dojke. Analiza THBS1 v frakciji PBMC pacientk z rakom dojke pred terapijo je pokazala povišano izražanje tega gena v skupini TNRD v primerjavi z ostalimi podtipi raka dojke in zdravimi kontrolami, vendar v naši kohorti razlika v izražanju ni dosegla statistične signifikance. Pri analizi prekurzorske oblike miR-137 v plazmi pred in po terapiji smo naleteli na tehnične težave, zato bo za to analizo potrebna dodatna optimizacija postopka.
Keywords: rak dojk, TNRD, PBMC, CXCR4, THBS1, miR-137, genska ekspresija
Published in DKUM: 26.09.2022; Views: 641; Downloads: 55
Full text (3,60 MB) |
6. |
7. Znanje, odnos in navade žensk o samopregledovanju dojkNastja Špelec, 2021, undergraduate thesis Abstract: Rak dojke predstavlja velik zdravstveni problem po svetu, saj je eden izmed vodilnih vzrokov smrti pri ženskah po menopavzi glede vseh malignih obolenj. Za pravočasno odkrivanje le-tega je pomembno redno izvajanje samopregledovanja dojk po 20. letu starosti. Namen zaključnega dela je bil ugotoviti, kakšno znanje, odnos in navade imajo ženske o samopregledovanju dojk. Pri izdelavi zaključnega dela smo uporabili sistematičen pregled znanstvene in strokovne literature. Članke, ki smo jih uporabili v zaključnem delu, smo pridobili v podatkovnih bazah CINAHL, PubMed, ScienceDirect in Web of Sciences. Članke smo kritično ocenili po Joanna Briggs Institute (JBI) kontrolnih seznamih. Za analizo in sintezo podatkov smo uporabili tematsko analizo. Od dobljenih 1532 zadetkov smo glede na primernost v končno analizo vključili devet člankov. Glavni rezultati analize so pokazali, da v večini ženske premalo izvajajo samopregledovanje dojk. Razlog za to je slabo znanje o tem, zaradi premajhnega informiranja žensk ter negativen odnos žensk do samopregledovanja dojk. Samopregledovanje dojk je pomembna metoda za zgodnje odkrivanje raka dojk, zato je bistveno, da se o tehniki le-tega več govori. S tem bi pripomogli k izboljšanju znanja in odnosa žensk do smopregledovanja.
Keywords: Ženske, samopregledovanje dojk, rak dojk.
Published in DKUM: 29.11.2021; Views: 981; Downloads: 195
Full text (547,78 KB) |
8. |
9. |
10. Primerjava obsevalnih tehnik po ohranitveni operaciji raka leve dojkeIvica Ratoša, 2019, doctoral dissertation Abstract: Najpogostejši neželeni učinki obsevanja so zgodnje spremembe na koži in v področju žleznega tkiva dojke, redkejši pa pozne reakcije na koži, pljučih ali srcu. Stopnja srčne okvare je s sodobnim načrtovanjem obsevanja sicer nizka, vendar je ob vse daljši pričakovani življenjski dobi in sočasni višji prevalenci raka dojk vse več žensk izpostavljenih morebitnim poznim posledicam zdravljenja. Srčna obolenja, pogosteje povzročena z dopolnilnim obsevanjem leve strani prsnega koša, postajajo eden izmed glavnih vzrokov smrti pri ozdravljenih bolnicah z rakom dojk.
Z raziskavo smo primerjali dozno-volumske parametre tarčnih volumnov in zdravih organov za tri različne obsevalne tehnike in želeli ugotoviti najbolj primerno tehniko za bolnice z različno velikimi obsevalnimi volumni. Za izbrane bolnice po operaciji zaradi raka leve dojke, smo primerjali tridimenzionalno konfromno obsevanje (3D-CRT), tangencialno obliko intenzitetne modulirane terapije (T-IMRT) in hibridno obliko, ki predstavlja kombinacijo tehnik 3D-CRT ter IMRT (H-IMRT). Dodatni cilj je bila poglobljena analiza dozno-volumskih parametrov srčnih votlin in koronarnih arterij. V analizo smo vključili 60 CT-posnetkov bolnic, ki so se med letoma 2014 in 2015 zdravile z obsevanjem po operaciji raka leve dojke. Na vsak set CT-slik smo vrisali kritične zdrave organe, vključno s posameznimi strukturami srca ter tarčne volumne. Analizirali smo 180 obsevalnih načrtov. CT-posnetke smo razvrstili v skupino z majhnim, srednjim in velikim kliničnim tarčnim volumnom (CTV).
V prvi skupini je srednja velikost CTV znašala 425,7 cm3, v drugi 867 cm3 in v tretji 1586,8 cm3. 95-odstotna pokritost načrtovalnega tarčnega volumna za oceno doze (PTVeval)je s tehnikama 3D-CRT in H-IMRT znašala 100 % in s T-IMRT v 88,3 %. Relativni deleži odvečne predpisane doze v načrtovalnem tarčnem volumnu PTVeval (V105–107 %) so bili najnižji s 3D-CRT, absolutni deleži pa s T-IMRT ali H-IMRT. Vrednosti indeksov konfomnosti, homogenosti ter konformacijskega števila so bile najbolj optimalne pri tehniki H-IMRT. Za celotno skupino obsevalnih načrtov smo potrdili prednost dozne razporeditve v strukturi koža za obe IMRT tehniki.
Izkazalo se je, da tehnika obsevanja pomembno vpliva tudi na povprečno absorbirano dozo srca (srce Dmean). Najnižje vrednosti smo beležili pri tehniki 3D-CRT, in sicer 1,9 Gy, sledila je T-IMRT z 2,3 Gy in kot najslabša se je izkazala H-IMRT s 3,1 Gy povprečne absorbirane doze srca (p < 0,0005). Nasprotno pa smo najnižje vrednosti visokodoznih območij za parametra srce (V35–40 Gy) ter za levo sprednjo koronarno arterijo (angl. left anterior descending coronary artery, LADCA) (V40 Gy) zabeležili prav pri tehniki H-IMRT. Naši rezultati nakazujejo, da so lahko razlike v povprečni absorbirani dozi srca ali levega prekata posledica uporabljene tehnike obsevanja ali pa telesne konstitucije bolnice. Tudi ob zelo nizki vrednosti srce Dmean (< 2,5 Gy) pa lahko posamezni srčni segmenti, predvsem srednji in distalni segment LADCA ter apikalni in sprednji predel levega prekata, prejmejo bistveno višje doze, celo 30–40 Gy. Pri analizi povprečne absorbirane doze priležnega pljučnega krila smo ugotovili, da najnižje srednje vrednosti dosegamo s tehniko 3D-CRT, in sicer 5,6 Gy, višje pri T-IMRT s 5,7 Gy in najvišje ponovno pri tehniki H-IMRT z 8,7 Gy (p = 0,012).
Obsevalna tehnika izbire za večino bolnic po ohranitveni operaciji zaradi raka leve dojke je 3D-CRT, saj smo z njo pri večini obsevalnih načrtov dosegli potrebne zahteve pri načrtovanju. Predvsem za bolnice s srednje velikimi tarčnimi volumni je optimalna tehnika izbire tudi T-IMRT. Za bolnice z izjemno velikimi ali kompleksneje oblikovanim tarčnimi volumni pa sta tehniki izbire 3D-CRT in izjemoma tudi H-IMRT. Pri bolnicah, pri katerih ugotovimo višjo absorbirano dozo na posamezne srčne segmente, pri mlajših bolnicah in pri tistih s pridruženimi dejavniki tveganja za okvaro srca, svetujemo skrbnejše sledenje morebitnih okvar na srcu.
Keywords: Rak dojk, tridimenzionalno konformno obsevanje, intenzitetno modulirano obsevanje, velikost dojk
Published in DKUM: 24.12.2019; Views: 1740; Downloads: 135
Full text (3,28 MB) |
