Search the digital library catalog

Abstract: Encimi, v največjem deležu proteini, so znani tudi kot biološki katalizatorji. Pospešujejo kemijske reakcije v živih organizmih in so ključni biokatalizatorji z obsežnimi aplikacijami v biotehnologiji. Njihovo uporabo pogosto omejuje nizka stabilnost in možnost enkratne uporabe. Postopek imobilizacije izboljšuje stabilnost encima in omogoča, da encim večkrat uporabimo. Diplomsko delo se osredotoča na optimiranje pogojev imobilizacije lizocima na magnetne nanodelce, prevleče z arabinogalaktanom, z namenom, da bi dosegli najvišjo aktivnost imobiliziranega encima in učinkovitost imobilizacije. Arabinogalaktan (AG) je biopolimer, sestavljen iz monosaharidov arabinoze in galaktoze [1]. Najprej smo izvedli sintezo magnetnih nanodelcev, prevlečenih z arabinogalaktanom (AG-MNPs). Tako sintetizirane in modificirane magnetne nanodelce smo uporabili kot nosilec za imobilizacijo encima lizocima. Pred imobilizacijo lizocima, smo delce funkcionalizirali z mrežnim povezovalcem gluteraldehidom (GA). Uporaba GA pomembno vpliva na aktivnost encima in učinkovitost imobilizacije, saj zagotavlja proste funkcionalne skupine, na katere se lahko veže encim. Določili smo optimalno koncentracijo encima, rotacijsko hitrost stresanja med funkcionalizacijo in imobilizacijo (350 obr/min), čas funkcionalizacije zamreževalca na magnetne nanodelce (1 ura) in čas imobilizacije lizocima (2 uri) ter koncentracijo dodanega GA kot zamreževalca. Aktivnost imobiliziranega encima in učinkovitost imobilizacije smo določili z aktivnostnim testom za lizocim ter Bradfordovo metodo za določevanje totalnih proteinov. Rezultati so pokazali, da je lizocim koncentracije 30 mg/mL, ki ga imobiliziramo na predhodno funkcionalizirane delce z GA koncentracije 20 (v/v) %, imel najvišjo aktivnost (148 %) Optimirali smo čas funkcionalizacije (1 ura) in imobilizacije (2 uri) pri hitrosti stresanja 350 obratov/min. V primeru imobilizacije lizocima brez zamreževalca, smo optimirali rotacijsko hitrost 350 obr/min, koncentracijo encima 20 mg/mL in čas imobilizacije, ki znaša 2 uri.
Keywords: lizocim, imobilizacija encima, AG-MNPs, preostala aktivnost
Published in DKUM: 19.09.2024; Views: 0; Downloads: 4
Full text (1,72 MB)

Abstract: Antibiotiki so vrsta protimikrobnih zdravil, ki se uporabljajo za zdravljenje bakterijskih okužb. Odkritje penicilina (PEN) je bilo nedvomno eno najpomembnejših znanstvenih odkritij v novejši zgodovini, saj je rešilo mnogo življenj. Vendar pa je kljub uspešnemu zdravljenju z antibiotiki dolgotrajna uporaba le-teh privedla do razvoja odpornosti bakterij na te zdravilne učinkovine. Ko se antibiotiki izločajo in končajo v okolju, lahko vplivajo na ekosisteme in s tem na razvoj bakterijske odpornosti. To je postal globalen izziv, ki zahteva razvoj novih pristopov k odstranjevanju antibiotikov iz okolja. S tem namenom smo v diplomski nalogi izvedli študijo razgradnje PEN z uporabo imobiliziranega encima na aminosilanske magnetne nanodelce (AMN-MNPs). Uporabili smo encim β-laktamazo, ki razgrajuje beta laktamske antibiotike, med katere spada tudi PEN. Najprej smo sintetizirali AMN-MNPs na katere smo imobilizirali encim β-laktamazo. Proučili smo termično stabilnost in večkratno uporabo imobiliziranega encima ter določili aktivnost imobiliziranega encima in učinkovitost imobilizacije. Izvedli smo tudi primerjavo encimske kinetike med prosto in imobilizirano β-laktamazo z eksperimentalno določitvijo KM in vmax. Proučevali smo razgradnjo PEN s prostim in imobiliziranim encimom ter vpliv koncentracije encima in koncentracije PEN na hitrost razgradnje le-tega. Razgradnjo PEN smo zasledovali s pomočjo HPLC sistema. Rezultati so pokazali, da je bila učinkovitost imobilizacije 100,00 %. Imobilizirano β-laktamazo lahko večkrat uporabimo in je termično stabilnejša od proste β-laktamaze. Z določitvijo kinetičnih parametrov smo ugotovili, da ima imobilizirana β-laktamaza višjo afiniteto do substrata kot prosta β-laktamaza, kar pomeni, da se imobilizirana β-laktamaza učinkovitejše veže s substratom kot prosta β-laktamaza. Pri študiji razgradnje PEN smo ugotovili, da imobiliziran encim bolj učinkovito razgrajuje PEN (koncentracije 0,1 mg/mL) kot prosti encim, saj smo po 24 urah z imobilizirano β-laktamazo dosegli 97,75 % razgradnje PEN, medtem ko smo s prosto β-laktamazo dosegli le 22,21 % razgradnje PEN. Ko smo proučevali vpliv različnih koncentracij PEN smo ugotovili, da višja kot je koncentracija PEN, počasneje poteka njegova razgradnja. PEN koncentracije 0,05 mg/mL se je po petih urah popolnoma razgradil, medtem ko smo v istem času dosegli 45,00 % delež razgradnje PEN s koncentracijo 0,5 mg/mL. Na koncu smo znižali koncentracijo PEN na 0,01 mg/mL in ugotovili smo, da je se je po petih urah razgradilo 96,11 %, s tem pa smo potrdili, da razgradnja PEN poteka najhitreje pri koncentraciji 0,05 mg/mL.
Keywords: β-laktamaza, odpadna voda, penicilin, razgradnja, imobilizacija encima, MNPs, HPLC
Published in DKUM: 11.09.2023; Views: 547; Downloads: 136
Full text (3,65 MB)

Abstract: Imobilizacija encima na nosilec vpliva na stabilnost in aktivnost encima. V diplomskem delu je prikazana študija imobilizacije encima alkohol dehidrogenaze (ADH) na magnetne maghemitne nanodelce, prevlečene s karboksimetil dekstranom (CM-dekstranom). Imobiliziranemu encimu smo aktivnost določali po encimskem testu z merjenem absorbance s spektrofotometrom pri 340 nm, preostalo specifično aktivnost pa izračunali s primerjanjem aktivnosti imobiliziranega z aktivnostjo prostega encima. Določevali smo tudi učinkovitost imobilizacije, in sicer z merjenjem koncentracije proteinov po Bradfordovi metodi pri valovni dolžini 595 nm. Cilj je bil ugotoviti optimalne imobilizacijske pogoje za čim višjo preostalo specifično aktivnost imobiliziranega encima. Pogoje smo spreminjali postopoma in v vsakem naslednjem koraku uporabili optimalne pogoje prejšnjega koraka. Osnovna imobilizacija je potekala 2 uri na 20 °C, hitrost stresanja je bila 300 rpm, pH imobilizacijskega medija pa 7.5, na delce smo dodali 4 % (v/v) epiklorohidrina (ECH) in 0.02 mg/mL encima ADH. Na začetku smo raziskovali vpliv koncentracije ECH, ugotovili smo, da dobimo najvišje preostale aktivnosti imobiliziranega encima pri 4 % (v/v). Naslednji parameter je bila temperatura, ki smo jo za optimalne rezultate znižali na 4 °C. Povečali smo tudi hitrost stresanja na 500 rpm. Najvišje preostale aktivnosti imobiliziranega encima za optimalen pH medija, čas imobilizacije in koncentracijo encima pa so ostale enake, kot pri osnovni imobilizaciji, torej pH 7.5, čas imobilizacije 2 uri in koncentracija encima 0.02 mg/mL. Raziskovali smo tudi stabilnost imobiliziranega encima po 3 h, 5 h in 24 h na 20 °C in 40 °C, za encim, imobiliziran v osnovnih in optimalnih pogojih. Preverjali smo tudi možnosti shranjevanja imobiliziranega encima na 4 °C, za osnovno imobilizacijo 22 dni, za optimalno pa 30 dni. V obeh primerih smo ugotovili, da imobiliziran encim dobro ohranja aktivnost tudi po daljšem časovnem obdobju.
Keywords: alkohol dehidrogenaza, CM-dekstran, imobilizacija, maghemitni nanodelci, preostala specifična aktivnost, stabilizacija encima
Published in DKUM: 03.04.2019; Views: 1346; Downloads: 119
Full text (2,07 MB)

Abstract: Namen diplomske naloge je bil uspešno imobilizirati encim na biooglje, nosilec, ki je bil pripravljen s hidrotermično karbonizacijo odpadne biomase. S spreminjanjem koncentracije encima in z različno izbiro mrežnega povezovalca smo želeli izvesti imobilizacijo encima na biooglje, ki nam da najvišjo preostalo aktivnost encima. Zanimalo nas je, kaj se z aktivnostjo imobiliziranega encima dogaja pri izpostavitvi različnim dejavnikom kot sta temperatura in čas skladiščenja. Rezultati kažejo, da najvišjo preostalo aktivnost obdrži imobiliziran encim s koncentracijo 0,05 g/mL ter ob uporabi mrežnega povezovalca gluteraldehida, koncentracije 2 %. Čas imobilizacije encima je bil 24 ur. Na stresalniku smo uporabili hitrost stresanja 400 rpm. Pri izpostavitvi imobiliziranega encima določeni temperaturi smo ugotovili, da dalj časa je izpostavljen višji temperaturi, bolj bo njegova aktivnost padala. Pri različnem času skladiščenja pa smo prišli do zaključka, da aktivnost encima s časom skladiščenja prav tako pada.
Keywords: biooglje, hidrotermična karbonizacija, imobilizacija encima, lakaza, gluteraldehid
Published in DKUM: 22.10.2015; Views: 1795; Downloads: 127
Full text (1,68 MB)

Abstract: Namen diplomske naloge je bila uspešna imobilizacija komercialnega encimskega preparata DENILITE II S na hitozanske maghemitne nanodelce in primerjava aktivnosti imobiliziranega encima s prostim encimom. Sintetizirali smo hitozanske maghemitne nanodelce po metodi kovalentne vezave in nanje imobilizirali encim. Za aktivacijo funkcionalnih skupin nosilca smo uporabili mrežna povezovalca glutaraldehid (GA) in pentaetilen heksamin (PEHA). Z različnimi koncentracijami mrežnega povezovalca smo aktivirali funkcionalne skupine nosilca ter iskali optimalno učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost imobiliziranega encima. Zanimala nas je tudi stabilnost encima, kako vplivata čas in temperatura izpostavitve na ohranitev preostale aktivnosti imobiliziranega encima. Imobilizirani encim ima prednost pred prostim encimom, saj se lahko večkrat uporabi, zato smo preverili, kako vpliva večkratna uporaba na ohranitev preostale aktivnosti imobiliziranega encima. Najvišjo preostalo aktivnost imobiliziranega encima na hitozanske maghemitne nanodelce smo dosegli pri dodatku mrežnega povezovalca GA (3 %) in koncentraciji encima 0,05 g/mL. Encim, imobiliziran na hitozanske maghemitne nanodelce pri optimalnih pogojih, smo izpostavili za določen čas različnim temperaturam in opazili, da se preostala aktivnost ne ohrani. Proučevali smo tudi vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na preostalo aktivnost. Imobiliziran encim smo večkrat ponovno uporabili in ugotovili, da aktivnost encima z naraščanjem števila ciklov upada.
Keywords: nanotehnologija, nanomateriali, hitozanski maghemitni nanodelci, imobilizacija encima, encim lakaza, aktivnost encima.
Published in DKUM: 09.09.2014; Views: 2149; Downloads: 163
Full text (2,22 MB)