Search the digital library catalog

Abstract: Doktorska disertacija zajema dva dela, v prvem delu smo se osredotočili na sintezo magnetnega nosilca, modificiranega z organskim polimerom karboksimetil dekstranom (CMD). V sintezni postopek smo vpeljali tri različne koncentracije CMD (0,25 g/mL, 0,40 g/mL in 0,50 g/mL CMD) ter sintetizirali tri različne modificirane magnetne nanodelce (CMD1-MNPs, CMD2-MNPs in CMD3-MNPs). Sintetizirane CMD-MNPs smo okarakterizirali z različnimi analiznimi metodami: Fourier-transformirano infrardečo spektroskopijo (FT-IR), termogravimetrično analizo (TGA), vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM), energijsko disperzijsko spektroskopijo (EDS), transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), z meritvami dinamičnega sipanja svetlobe (DLS). Magnetne lastnosti smo določili z elektronsko paramagnetno resonanco (EPR) in vibracijskim magnetometrom (VSM). Uspešno smo sintetizirali magnetne nosilce CMD-MNPs z ozkimi porazdelitvami nanovelikosti od 27-30 nm. S FT-IR analizo smo določili prisotnost karboksilnih in hidroksilnih skupin na površini CMD-MNPs, kar potrjuje prisotnost polimerne prevleke CMD na sintetiziranih MNPs. Z meritvami EPR in VSM smo dokazali, da imajo sintetizirani CMD-MNPs magnetne lastnosti ter feromagnetni sistem. Določili smo inhibitorne lastnosti CMD-MNPs na rast dveh bakterijskih kultur. Inhibitorne učinke na rast testnih mikroorganizmov smo zaznali pri CMD3-MNPs, medtem ko ostali CMD-MNPs in neprevlečeni MNPs ne izkazujejo antimikrobne učinkovitosti. Proučevali smo tudi inhibitorne lastnosti MNPs modificiranih s hitozanom (HIT-MNPs) in aminosilanom (AMS-MNPs) na petih različnih bakterijskih kulturah, pri katerih nismo zaznali inhibiornega učinka na rast izbranih mikororganizmov. Za nadaljnje raziskave smo izbrali CMD3-MNPs, na katerega smo vezali encim alkohol dehidrogenazo (ADH). V drugem delu doktorske disertacije smo nosilec CMD3-MNPs površinsko funkcionalizirali z epiklorohidrinom (EClH). Optimalna koncentracija EClH je znašala 4 % (v/v). Proučevali smo vpliv različnih procesnih parametrov na preostalo aktivnost in učinkovitost imobilizacije ADH na CMD3-MNPs. Pri optimalnih pogojih imobilizacije ADH na CMD3-MNPs smo dosegli 89,6 % preostalo aktivnost imobilizirane ADH in 99,5 % učinkovitost imobilizacije. Nadaljevali smo s postopkom koimobilizacije, pri čemer smo na funkcionaliziran nosilec CMD3-MNPs koimobilizirali encim ADH in kofaktor β-nikotinamid adenin dinukleotid (β-NAD). S spreminjanjem procesnih parametrov smo proučevali njihov vpliv na preostalo aktivnost imobilizirane ADH s kofaktorjem β-NAD na CMD3-MNPs in učinkovitost koimobilizacije. Pri optimalnih pogojih koimobilizacije ADH in β-NAD na CMD3-MNPs smo dosegli 73,3 % preostalo aktivnost ADH ter 93,8 % učinkovitost imobilizacije. Izvedli smo še študijo termične stabilnosti proste ADH, ADH imobilizirane na CMD3-MNPs in ADH koimobilizirane z β-NAD na CMD3-MNPs pri različnih temperaturah. ADH imobilizirana na CMD3-MNPs je ohranila skoraj 60 % svoje začetne aktivnosti po 24. urah inkubacije pri temperaturah 20 °C in 40 °C. ADH koimobilizirana z β-NAD na CMD3-MNPs je pri temperaturi 30 °C ohranila 75,4 % začetne aktivnosti, pri 50 °C pa 66,5 % začetne aktivnosti po 5. urah inkubacije. Proučili smo še stabilnost ADH imobilizirane na CMD3-MNPs in ADH koimobilizirane z β-NAD na CMD3-MNPs, ki smo ju skladiščili pri 4 °C. Po treh tednih sta obe obliki imobilizrane ADH ohranili 60 % svoje začetne aktivnosti. Magnetne nosilce HIT-MNPs in AMS-MNPs smo funkcionalizirali z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA) in amino-donorjem pentaetilenheksaminom (PEHA), na katere smo imobilizirali encim β-galaktozidazo (β-GAL) ter optimirali koncentraciji GA in PEHA. Pri kombinaciji obeh GA in PEHA smo dosegli hiperaktivacijo encima (128,9 %), do katere pride zaradi konformacijskih sprememb encima. Hiperaktivacijo smo dosegli tudi pri imobilizaciji β-GAL na AMS-MNPs. Najvišjo preostalo aktivnost β-GAL smo dosegli, kadar smo kot mrežni povezovalec uporabili 20 % (v/v) PEHA (154,4 %).
Keywords: magnetni nanodelci, karboksimetil dekstran, karakterizacijska analiza, funkcionalizacija, epoksi zamreževanje, epiklorohidrin, glutaraldehid, encimi, imobilizacija, koimobilizacija, β-nikotinamid adenin dinukleotid, alkohol dehidrogenaza, β-galaktozidaza, kinetični parametri
Published in DKUM: 13.05.2020; Views: 1974; Downloads: 326
Full text (9,26 MB)

Abstract: Namen našega dela je bil pripraviti zamrežene encimske skupke (CLEA) in magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEA) iz encima β-galaktozidaze. Doseči smo želeli čim višjo preostalo aktivnost encima in čim višjo učinkovitost imobilizacije. Zamreženje smo preizkušali v štirih obarjalnih reagentih (acetonu, etanolu, 1-propanolu in 2-propanolu), dodajali smo ogrodne proteine in mrežne povezovalce v različnih kombinacijah in koncentracijah. Eksperimentalno delo je obsegalo pripravo vzorcev (obarjanje in zamreženje), aktivnostni test in Bradfordovo metodo za določanje koncentracije proteinov. Proces smo optimirali pri konstantni koncentraciji encima (50 mg/ml) in konstantnem dodatku glutaraldehida (GA). Ugotovili smo, da je optimalna količina dodanega mrežnega povezovalca GA 1.5% (v/v) in da mrežni povezovalec pentaetilenheksamin (PEHA) negativno vpliva na zamreženje, razen če ga dodajamo v kombinaciji z ogrodnimi proteini. V tem primeru se preostala aktivnost zviša, medtem ko učinkovitost imobilizacije močno upade.
Keywords: biokataliza, β-galaktozidaza, imobilizacija encima, zamreženi encimski skupki, magnetni nanodelci
Published in DKUM: 30.03.2017; Views: 1718; Downloads: 202
Full text (2,12 MB)

Abstract: Namen magistrskega dela je primerjava kemijske in fizikalne metode imobilizacije encima ter imobilizacije encima brez nosilca, tj. v tako imenovane zamrežene encimske skupke. Za imobilizacijo smo uporabili encim ß-galaktozidazo, kateri razgrajuje disaharid laktozo na monosaharida, glukozo in galaktozo. V okviru magistrske naloge smo uspešno sintetizirali magnetne nanodelce maghemita, katere smo funkcionalizirali z aminoorganosilani in hitozanom. Encim smo kovalentno vezali na aminosilanske ter hitozanske magnetne nanodelce maghemita. Preizkusili smo tudi ujetje encima v netopnem gelu, za kar smo uporabili natrijev alginat. Uspešno smo sintetizirali tudi zamrežene encimske skupke. Encim smo oborili v zamrežene encimske skupke in z dodatkom mrežnih povezovalcev in stabilizacijskih proteinov med postopkom optimirali aktivnost encima. Primerjalno z vsemi tremi tehnikami imobilizacije encima ß-galaktozidaze se je kot najmanj uspešna izkazala ujetje encima v natrijevem alginat. Sledi sinteza zamreženih encimskih skupkov ter kovalentna vezava encima na aminosilanke in hitozanske magnetne nanodelce maghemita. Oba načina imobilizacije sta se izkazala kot zelo dobra izbira imobilizacije ß-galaktozidaze.
Keywords: ß-galaktozidaza, zamreženi encimski skupki, magnetni nanodelci maghemita, natrijev alginat, mrežni povezovalec
Published in DKUM: 04.04.2016; Views: 2153; Downloads: 236
Full text (2,77 MB)

Abstract: Hidroliza laktoze je reakcija, ki lahko poteka s kemijskim ali encimskim katalizatorjem. Laktoza predstavlja velik problem ljudem, ki je zaradi pomanjkanja encima v prebavnem traktu ne morejo hidrolizirati. Z raziskavami v okviru diplomskega dela smo to reakcijo izvajali v šaržnem reaktorju z uporabo imobiliziranega encima β – galaktozidaze, pri čemer laktoza razpade na glukozo in galaktozo. Namen dela je bil v prvi fazi imobilizirati encim, ter kasneje ob spreminjanju dveh ključnih procesnih parametrov zasledovati stopnjo presnove reakcije. Zato smo izbrano reakcijo izvajali pri različnih temperaturah in različnih vrtilnih ferkvencah mešala. S pridobljenimi podatki smo določili optimalne pogoje delovanja encima in potrdili znana dejstva, da višja temperatura in hitrejša vrtilna ferkvenca mešala višata presnovo reakcije. Te meritve so temelj nadaljnjih kinetičnih študij hidrolize laktoze. Kinetični model namreč omogoča opis značilnosti izbrane reakcije in je nujno potreben za kasnejše načrtovanje reaktorjev. Encim lahko pridobivamo iz bakterij, gliv in kvasovk. Glede na izvor encima, je različno tudi njegovo optimalno okolje. Za naše raziskave smo uporabljali encim laktazo iz Kluyveromices fragilis. Določili smo, da je zanjo optimalna temperatura pri ϑ = 45 °C. Optimalno vrtilno frekvenco mešala smo zabeležili pri 50 min-1. Velik vpliv na presnovo smo zasledili tudi pri samem postopku imobilizacije.
Keywords: laktoza, β – galaktozidaza, imobilizacija, hidroliza, procesni parametri
Published in DKUM: 26.09.2013; Views: 2596; Downloads: 264
Full text (2,05 MB)