21. Primerjava bioinformatskih orodij za anotacijo podatkov eksoma pridobljenih z dna sekvenciranjem naslednje generacijeMiklavž Toplak, 2021, master's thesis Abstract: Uvod: Genomska anotacija je ključen korak po sekvenciranju DNA, saj nam pomaga identificirati ključne funkcionalne elemente nukleotidnega zaporedja ter nam s tem priskrbi pomen nukleotidnega zaporedja, ki nas zanima. Eksom je definiran kot nukleotidno zaporedje, ki obsega vse eksome vseh genov, ki kodirajo proteine v genomu. Eksom predstavlja med 1 in 2 % celotnega genoma, vsebuje pa kar 85 % znanih različic, ki povzročajo bolezni.
Metode: V empiričnem delu naloge smo v začetku zbrali vsa izbrana orodja za anotacijo in jih naložili na naš namizni računalnik, nato pa smo z vsakim od orodij izvedli anotacijo na podatkih pridobljenih v laboratoriju Centra za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko Medicinske fakultete Univerze v Mariboru s sekvenciranjem naslednje generacije DNA izoliranih iz 24 bolnikov. Podatke sekvenciranja eksoma v VCF formatu smo analiziraliz bioinformatskimi orodji ANNOVAR, Exomiser, VarAFT, SnpEff in Ensembl VEP. Vsa orodja z izjemo VarAFT so orodja, ki se zaganjajo iz ukaznega poziva, medtem ko VafAFT deluje kot samostojna aplikacija. Ko smo zaključili z anotacijo vseh vzorcev, smo v teh anotiranih vzorcih skušali poiskati vzročne mutacije, ki smo jih pridobili predhodno, pri čemer smo uporabili tudi orodje za filtriranje SnpSift.
Rezultati: Rezultati anotacije z izbranimi orodji so se med posameznimi orodji nekoliko razlikovali pri vrednostih vmesnih parametrov, ki jih orodja izračunajo na podlagi svojih algoritmov, medtem ko smo pri zaznavanju tipov in lokacij različic ter tega, kaj določena različica povzroči, dobili dokaj podobne rezultate. Rezultati primerjave orodij, ki smo jo izvedli na podlagi tega, ali je orodje zaznalo vzročno mutacijo v vzorcu, pa so nam pokazali, da se orodja med seboj kar precej razlikujejo, saj je orodje ANNOVAR zaznalo 50 % vseh vzročnih mutacij, VarAFT 35,7 %, Exomiser 28,5 %, medtem ko sta orodji SnpEff in VEP zaznali le 21,4 % vseh vzročnih mutacij.
Diskusija: Ugotovili smo, da je bilo orodje ANNOVAR najuspešnejše pri zaznavanju vzročnih mutacij. Zaradi majhnega števila vzorcev (14 vzročnih mutacij v 24 vzorcih) bo rezultate naše primerjave učinkovitosti preiskovanih orodij potrebno potrditi še na večjem številu vzorcev.
Keywords: NGS, anotacija, bioinformatika, eksom
Published in DKUM: 10.01.2022; Views: 1275; Downloads: 118
 Full text (7,93 MB) |
22. Kontrola kvalitete podatkov pridobljenih z mikromrežami za genotipizacijo DNA polimorfizmovAna Konrad, 2021, master's thesis Abstract: Uvod: V raziskavah z uporabo mikromrež lahko različni faktorji vodijo do uvedbe sistematičnih pristranskosti in napak v študiji, zato je pomemben korak v vsaki raziskavi kontrola kvalitete podatkov. Z njo se odstranijo napačni ali pomanjkljivi podatki, kot so lažno pozitivne in negativne vrednosti, ki lahko pomembno vplivajo na rezultate analize. S predhodno izvedbo kontrole kvalitete lahko zagotovimo zanesljivejše končne rezultate analiz. V naši nalogi smo želeli dokazati pomembnost kontrole kvalitete pri podatkih za tri različne bolezni, ki smo jih pridobili z mikromrežami za genotipizacijo DNA polimorfizmov, tako da smo primerjali rezultate asociacijskih analiz pred opravljeno kontrolo podatkov in po njej.
Metode: Za asociacijsko analizo in kontrolo kvalitete podatkov smo uporabili program PLINK in programski jezik R. Rezultate pred kontrolo kvalitete in po njej smo grafično predstavili ter izračunali genomski inflacijski faktor lambda. Razliko med rezultati asociacijskih analiz smo statistično ovrednotili z Wilcoxonovim testom predznačenih rangov.
Rezultati: Z Wilcoxonovim testom predznačenih rangov smo ugotovili, da se rezultati asociacijskih analiz, pridobljeni pred kontrolo kvalitete podatkov in po njej statistično značilno razlikujejo (p-vrednost za bolezen 1 < 2,2 × 10-16, p za bolezen 2 = 0,0003181 in p za bolezen 3 < 2,2 × 10-16). Razliko med podatki asociacijskih analiz, pridobljenimi pred kontrolo podatkov in po njej, smo dokazali tudi z grafičnim prikazom lambda vrednosti, iz katerega je razvidno, da je lambda vrednost po kontroli kvalitete bližje 1, kar pomeni, da smo uspešno odstranili lažno pozitivne in negativne vrednosti.
Razprava in sklep: V nalogi smo dokazali, da kontrola kvalitete močno vpliva na končne rezultate analize in je zato zelo pomemben korak v analizi podatkov, pridobljenih z mikromrežami za genotipizacijo DNA polimorfizmov.
Keywords: kontrola kvalitete, mikromreže, asociacijska analiza, PLINK, R
Published in DKUM: 24.12.2021; Views: 729; Downloads: 60
Full text (1,15 MB) |
23. Integracija genske ontologije, transkriptomike in genomike za identifikacijo genetskih lokusov povezanih s pljučno funkcijo pri otrocih z astmo, ki se zdravijo z inhalacijskimi kortikosteroidiMartina Krušič, 2021, master's thesis Abstract: Uvod: Astma je heterogena respiratorna bolezen, ki pogosto prizadene tudi otroško populacijo. Simptomi astme se glede na resnost razlikujejo, zdravljenje pa najpogosteje poteka z inhalacijskimi kortikosteroidi (ICS). Odziv na zdravljenje je heterogen in genetsko pogojen. V okviru naše študije smo z uporabo integracije - omik identificirali nove genetske lokuse, povezane z odzivom na ICS.
Metode: Z uporabo različnih podatkovnih baz smo pridobili podatke o genih, ki smo jih analizirali z različnimi pristopi znotraj orodij in aplikacij. Statistično značilne signale smo preverili z RNA-seq analizo, v katero smo vključili šest posameznikov slovenskega porekla. Za tri najbolj statistično značilne gene smo izvedli še asociacijsko analizo in jih funkcijsko ovrednotili.
Rezultati: S pojmi genske ontologije smo povezali 47 različnih genov, v nadaljevanju pa smo z RNA-seq analizo potrdili tri gene, GNAS (p = 9,18 × 10^-4), CREBBP (p = 1,28 × 10^-3) in EP300 (p = 2,73 × 10^-3), statistično značilno povezane z odzivom na ICS. Z asociacijsko analizo smo pregledali področje ±100 kbp od predhodno navedenih genov, pri čemer je šest SNP-jev doseglo statistično značilno povezavo z ICS-jem. SNP-ja rs236729 in rs118065748 smo v nadaljevanju tudi ovrednotili z uporabo in silico funkcijske analize.
Razprava in sklep: Z integracijo - omik smo uspešno identificirali šest SNP-jev, ki so povezani z odzivom na ICS.
Keywords: otroška astma, FEV1, inhalacijski kortikosteroidi, pljučna funkcija
Published in DKUM: 09.09.2021; Views: 1182; Downloads: 137
Full text (2,78 MB) |
24. Implementacija avtomatiziranega pristopa k analizi podatkov DNA sekvenciranjaDragana Bjelić, 2020, master's thesis Abstract: Uvod: Z razvojem tehnologije sekvenciranja DNA in naraščanjem podatkov se povečuje tudi potreba po kvalitetni analizi in interpretaciji podatkov. Prav tako sta pomembna hitrost in zanesljivost klasificiranja posameznikov za določen genotip. Pri metodi sekvenciranja naslednje generacije (NGS) to klasificiranje temelji na klicanju različic, ki je sklepanje, da na določenem mestu obstaja razlika v nukleotidu v primerjavi z referenčnim nukleotidnim zaporedjem. Surovi podatki pridobljeni z NGS analizo so podani v datoteki VCF (ang. variant call format), kjer je v tabeli potencialnih različic oziroma kandidatnih genotipov v spremenljivki Filter pogosto uporabljena oznaka PASS za različice oziroma genotipe za katere je klasifikator nevronske mreže podal višjo verjetnost nereferenčnega klica genotipa kot za referenco, tj. zanesljiv klic različice. V magistrskem delu želimo s primerjavo števila klicanih različic in PASS različic med obstoječim in nadgrajenim pristopom pokazati pomembnost posodobitev programskih orodij.
Metode: V empiričnem delu smo implementirali avtomatiziran pristop k analizi podatkov DNA sekvenciranja, ki je nadgradnja obstoječega protokola analize, ki je na razpolago na aparatu Illumina Miseq. V našem nadgrajenem protokolu smo namesto modula GATK Variant Caller iz različice v1.6. obstoječega orodja na aparatu Illumina MiSeq uporabili modul Haplotype Caller pridobljenega iz programskega paketa GATK v3.8. Haplotype Caller je natančnejši, saj zavrne podatke o poravnavi okoli položaja, kjer se sumi na različico in ponovno prebere odčitke v tej regiji. Prav tako smo nadgradili algoritem poravnave nukleotidnih zaporedij iz različice 0.7.9 v obstoječem protokolu na 0.7.12, ki nam z nadgradnjo omogoča HLA tipizacijo. Protokol smo nadgradili tudi s predhodnim obrezovanjem tehničnih nukleotidnih zaporedij. Na koncu smo analizo števila klicanih različic in PASS različic med obema pristopoma ovrednotili v programskem okolju R z Wilcoxon-ovim statističnim testom.
Rezultati: Rezultati Wilcoxon-ovega testa so pokazali močno statistično značilno razliko med odkritim številom klicanih različic in PASS različic med nadgrajenim in obstoječim pristopom, pri čemer je nadgrajen pristop v povprečju odkril 26-krat več klicanih različic in 33 krat več PASS različic, od tega 5 pozitivnih PASS različic pomembnih za diagnozo od 12, kar pomeni 41,7 %.
Diskusija: Ugotovili smo, da je nadgrajen tekoči trak ukazov za analizo nukleotidnega zaporedja DNA učinkovitejši, saj odkrije več klicanih in PASS različic.
Keywords: NGS, bioinformatika, sekvenciranje, Illumina MiSeq
Published in DKUM: 21.09.2020; Views: 1484; Downloads: 274
Full text (7,38 MB) |
25. Molekularna patogeneza revmatoidnega artritisa in osteoartritisa z uporabo genske ontologijeAnja Grušovnik, 2019, master's thesis Abstract: Revmatoidni artritis in osteoartritis sta najpogosteje prisotni vrsti artritisa. Osteoartritis je primarno degenerativna bolezen sklepov, revmatoidni artritis pa je kronična avtoimunska bolezen. Obe bolezni sta z genetskega vidika kompleksni. Z revmatoidnim artritisom je do danes povezanih približno 100 lokusov, z osteoartritisom pa 64. Glavni namen naloge je bil s pomočjo uporabe asociacijskih študij, genske ontologije in bioinformatskih orodij odkriti molekularne biološke poti in procese, ki so odgovorni za nastanek in razvoj obeh bolezni ter jih med seboj primerjati. Dve izmed glavnih metod raziskovanja patofizologije sta genska ontologija in asociacijske študije celotnega genoma. Izvedena je bila meta-statistična analiza več polimorfizmov za obe bolezni. Uporabili smo različna bioinformatska orodja. Izdelana je bila tudi vizualizacija omrežij molekularnih interakcij in bioloških poti. Pri meta-statistični analizi izbranih polimorfizmov za osteoartritis je bil DVWA edini signifikanten gen, pri revmatoidnem artritisu pa PTPN22, CTLA4, STAT4, AFF3, CD40 in KIF5A. Rezultati programa DAVID so podali 2 signifikantna klastra za osteoartritis ter 13 signifikantnih klastrov za revmatoidni artritis. Bolezni si delita 260 skupnih ključev genske ontologije in 31 genov. Pri vizualiziranih mrežah bioloških poti smo lahko našli nekatere podobnosti, zlasti pri pozitivnih in negativnih regulacijah bioloških procesov; zanimive so bile tudi podobnosti znotraj imunskega sistema in ubikvitinacije. Naše domneve so tako bile utemeljene: z GWA študijami in pristopom genske ontologije smo lahko zbrali podatke in izpostavili pomembne biološke procese obeh bolezni ter jih med seboj primerjali. Izkazalo se je tudi, da so nekatere molekularne interakcije in biološke poti primerljive.
Keywords: GWAS, meta-statistična analiza, DAVID, Cytoscape, vizualizacija
Published in DKUM: 11.11.2019; Views: 1803; Downloads: 164 (1 vote)
Full text (4,85 MB) |
26. Primerjava pristopov edgeR in voom za analizo diferencialnega izražanja genov na podlagi podatkov sekvenciranja transkriptomaLara Bezjak, 2019, master's thesis Abstract: Izhodišče: Z razvojem visoko zmogljivih tehnologij sekvenciranja, ki so omogočile pridobitev velike količine podatkov iz bioloških vzorcev, je hitro naraslo tudi število programskih orodij za urejanje teh podatkov, vendar pa trenutno še ni soglasja o najprimernejšem postopku ali metodi za identifikacijo različno izraženih genov s tehnologijo sekvenciranja naslednje generacije (RNA-seq). Namen naloge je bil analizirati dva pristopa za analizo RNA-seq podatkov in njune rezultate validirati z zlatim standardom.
Metode: V nalogi smo uporabili dva pristopa, edgeR (Robinson, et al., 2010) in limma (Ritchie, et al., 2015) -voom (Law, et al., 2014), ter njune rezultate preverili z metodo RT-qPCR. Z RT-qPCR smo preverili štiri gene, ki so imeli izračunane nasprotujoče si log2FC in p-vrednosti. Na koncu smo zbrane rezultate vseh treh metod analizirali s programskim orodjem SPSS.
Rezultati: Rezultati Spearmanovega testa korelacije so pokazali močno korelacijo med izračunanimi log2FC in p-vrednostmi obeh pristopov, vendar je Wilcoxonov test pokazal, da se log2FC in p-vrednosti kljub temu statistično značilno razlikujejo glede na to, katero metodo smo uporabili. Tri gene, ki so se po metodah edgeR in voom najbolj razlikovali, smo analizirali z RT-qPCR in ugotovili, da dobljeni rezultati qRT-PCR bolj sovpadajo s pristopom voom kot z edgeR, kar je potrdil tudi Spearmanov test korelacije in Wilcoxonov test.
Diskusija: Iz rezultatov smo zaključili, da je pristop voom primernejši, saj daje zanesljivejše rezultate kot edgeR kljub temu da smo imeli zelo majhen vzorec (3 posameznike za vsako skupino).
Keywords: RNA sekvenciranje, transkriptomika, R, RT-qPCR, bioinformatika
Published in DKUM: 11.11.2019; Views: 1464; Downloads: 233
Full text (1,59 MB) |
27. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA)Jakob Naranđa, Lidija Gradišnik, Mario Gorenjak, Matjaž Vogrin, Uroš Maver, 2017, original scientific article Abstract: BACKGROUND: Cartilage tissue engineering is a fast-evolving field of biomedical engineering, in which the chondrocytes represent the most commonly used cell type. Since research in tissue engineering always consumes a lot of cells, simple and cheap isolation methods could form a powerful basis to boost such studies and enable their faster progress to the clinics. Isolated chondrocytes can be used for autologous chondrocyte implantation in cartilage repair, and are the base for valuable models to investigate cartilage phenotype preservation, as well as enable studies of molecular features, nature and scales of cellular responses to alterations in the cartilage tissue.
METHODS: Isolation and consequent cultivation of primary human adult articular chondrocytes from the surgical waste obtained during total knee arthroplasty (TKA) was performed. To evaluate the chondrogenic potential of the isolated cells, gene expression of collagen type 2 (COL2), collagen 1 (COL1) and aggrecan (ACAN) was evaluated. Immunocytochemical staining of all mentioned proteins was performed to evaluate chondrocyte specific production.
RESULTS: Cartilage specific gene expression of COL2 and ACAN has been shown that the proposed protocol leads to isolation of cells with a high chondrogenic potential, possibly even specific phenotype preservation up to the second passage. COL1 expression has confirmed the tendency of the isolated cells dedifferentiation into a fibroblast-like phenotype already in the second passage, which confirms previous findings that higher passages should be used with care in cartilage tissue engineering. To evaluate the effectiveness of our approach, immunocytochemical staining of the evaluated chondrocyte specific products was performed as well.
DISCUSSION: In this study, we developed a protocol for isolation and consequent cultivation of primary human adult articular chondrocytes with the desired phenotype from the surgical waste obtained during TKA. TKA is a common and very frequently performed orthopaedic surgery during which both femoral condyles are removed. The latter present the ideal source for a simple and relatively cheap isolation of chondrocytes as was confirmed in our study.
Keywords: aggrecan, collagen 2, gene expression, human articular chondrocytes, isolation protocol, phenotype preservation, TKA, total knee arthroplasty
Published in DKUM: 02.08.2017; Views: 1730; Downloads: 669
Full text (42,50 MB)
This document has many files! More... |
28. Vpliv hidrolizirajočih taninov iz izvlečkov kostanja na črevesne epitelijske celice humanega in prašičjega izvoraNeža Vidmar, 2017, master's thesis/paper Abstract: V magistrskem delu smo ugotavljali vpliv različnih koncentracij kostanjevih taninov na presnovo celic in izražanje toksičnih učinkov na epitelijske celice ter izražanje pozitivnih učinkov kostanjevih taninov na tesne celične stike med epitelijskimi celicami tankega črevesja humanega in prašičjega izvora. Za citotoksični test, test presnovne aktivnosti celic, test viabilnosti celic in funkcionalne celične 3-D modele smo uporabili prašičje enterocite CLAB in humane fetalne epitelijske celice tankega črevesja H4-1 ter hidrolizirajoče tanine iz izvlečkov kostanja, FARMATAN in FARMATAN ET 50. Pri izpostavitvi funkcionalnih celičnih 3D-modelov taninom in merjenju transepitelijske električne upornosti (TEER) smo uporabili elektrodo za merjenje električne upornosti in potenciala. V celicah, ki so bile izpostavljene višjim koncentracijam kostanjevih taninov, je prišlo do zmanjšane količine kristal vijoličnega. Pri presnovni aktivnosti celic so se pri višjih koncentracijah vrednosti absorbance v primerjavi s kontrolo znižale. Po izpostavitvi celičnih linij kostanjevemu taninu so vrednosti transepitelijske električne upornosti (TEER) glede na kontrolo naraščale.
Keywords: hidrolizirajoči tanini, črevesje, tesni stiki, funkcionalni 3D – celični modeli, transepitelijska električna upornost (TEER)
Published in DKUM: 11.07.2017; Views: 2835; Downloads: 178
Full text (639,05 KB) |
29. Polyester type polyHIPE scaffolds with an interconnected porous structure for cartilage regenerationJakob Naranđa, Maja Sušec, Uroš Maver, Lidija Gradišnik, Mario Gorenjak, Andreja Vukasović, Alan Ivković, Marjan Rupnik, Matjaž Vogrin, Peter Krajnc, 2016, original scientific article Abstract: Development of artificial materials for the facilitation of cartilage regeneration remains an important challenge in orthopedic practice. Our study investigates the potential for neocartilage formation within a synthetic polyester scaffold based on the polymerization of high internal phase emulsions. The fabrication of polyHIPE polymer (PHP) was specifically tailored to produce a highly porous (85%) structure with the primary pore size in the range of 50–170 μm for cartilage tissue engineering. The resulting PHP scaffold was proven biocompatible with human articular chondrocytes and viable cells were observed within the materials as evaluated using the Live/Dead assay and histological analysis. Chondrocytes with round nuclei were organized into multicellular layers on the PHP surface and were observed to grow approximately 300 μm into the scaffold interior. The accumulation of collagen type 2 was detected using immunohistochemistry and chondrogenic specific genes were expressed with favorable collagen type 2 to 1 ratio. In addition, PHP samples are biodegradable and their baseline mechanical properties are similar to those of native cartilage, which enhance chondrocyte cell growth and proliferation.
Keywords: polyester, polymerization, polyHIPE
Published in DKUM: 23.06.2017; Views: 1985; Downloads: 429
Full text (1,24 MB)
This document has many files! More... |
30. A co-culture model of the developing small intestine offers new insight in the early immunomodulation of enterocytes and macrophages by Lactobacillus spp. through STAT1 and NF-kB p65 translocationMartin Trapečar, Aleš Goropevšek, Mario Gorenjak, Lidija Gradišnik, Marjan Rupnik, 2014, original scientific article Abstract: The early establishment of a complete microbiome has been shown to play an integral part in the development and maintenance of an intact intestine and its immune system, although much remains unknown about the specific mechanisms of immune modulation in newborns. In our study we show in a co-culture model of the undeveloped small intestine that members of Lactobacillus spp. influence STAT1 and NF-kB p65 nuclear translocation in both intestinal epithelial cells as well as underlying macrophages. Moreover, by using imaging flow cytometry we were able to monitor each individual cell and create a framework of the percentage of cells in which translocation occurred in challenged versus control cell populations. We also observed a significant difference in baseline translocation in intestinal cells when cultured alone versus those in a co-culture model, underpinning the importance of 3D models over monolayer set-ups in epithelial in vitro research. In conclusion, our work offers new insights into the potential routes by which the commensal microbiome primes the early immune system to fight pathogens, and shows how strain-specific these mechanisms really are.
Keywords: microbiome, Lactobacillus, immune system, pathogens
Published in DKUM: 19.06.2017; Views: 1485; Downloads: 379
Full text (2,86 MB)
This document has many files! More... |
