1. Single-cell transcriptomic and targeted genomic profiling adjusted for inflammation and therapy bias reveal CRTAM and PLCB1 as novel hub genes for anti-tumor necrosis factor alpha therapy response in Crohn’s diseaseMario Gorenjak, Boris Gole, Larisa Goričan, Gregor Jezernik, Uršula Prosenc Zmrzljak, Cvetka Pernat Drobež, Pavel Skok, Uroš Potočnik, 2024, original scientific article Abstract: The lack of reliable biomarkers in response to anti-TNFα biologicals hinders
personalized therapy for Crohn’s disease (CD) patients. The motivation behind our study is to shift
the paradigm of anti-TNFα biomarker discovery toward specific immune cell sub-populations using
single-cell RNA sequencing and an innovative approach designed to uncover PBMCs gene expression
signals, which may be masked due to the treatment or ongoing inflammation; Methods: The singlecell
RNA sequencing was performed on PBMC samples from CD patients either naïve to biological
therapy, in remission while on adalimumab, or while on ustekinumab but previously non-responsive
to adalimumab. Sieves for stringent downstream gene selection consisted of gene ontology and
independent cohort genomic profiling. Replication and meta-analyses were performed using publicly
available raw RNA sequencing files of sorted immune cells and an association analysis summary.
Machine learning, Mendelian randomization, and oligogenic risk score methods were deployed to
validate DEGs highly relevant to anti-TNFα therapy response; Results: This study found PLCB1 in
CD4+ T cells and CRTAM in double-negative T cells, which met the stringent statistical thresholds
throughout the analyses. An additional assessment proved causal inference of both genes in response
to anti-TNFα therapy; Conclusions: This study, jointly with an innovative design, uncovered
novel candidate genes in the anti-TNFα response landscape of CD, potentially obscured by therapy
or inflammation.
Keywords: inflammatory bowel diseases, Crohn’s disease, tumor necrosis factor alpha, adalimumab, single-cell gene expression analysis
Published in DKUM: 10.12.2024; Views: 0; Downloads: 8
 Full text (7,36 MB)
This document has many files! More... |
2. Izražanje genov za DNA in RNA metilaze in demetilaze pri bolnikih z rakom glave in vratu : diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnjeKarmen Zorič, 2022, undergraduate thesis Abstract: Letna incidenca raka glave in vratu (RGV, angl. Head and Neck cancer, HNC) znaša okoli 700 000 novo odkritih primerov po celotnem svetu, kar ga izmed vseh bolezni uvršča na šesto mesto. Najpogostejša oblika RGV je ploščatocelični karcinom, ki predstavlja 85 % vseh primerov RGV. Za RGV so značilni različni simptomi, ki tudi pomagajo pri odkrivanju bolezni. Zdravljenje temelji na določitvi stopnje napredovanja bolezni. Epigenetske spremembe, kot sta DNA in RNA metilacija, spadajo med značilne spremembe karcinoma. Ker je ekspresija genov metilaz in demetilaz v tkivih RGV še vedno slabo raziskana, smo v sklopu diplomskega dela v tkivih bolnikov RGV dodatno proučili gensko ekspresijo nabora DNA in RNA metilaz in demetilaz ter njihovo ekspresijo povezali s klinično patološkimi značilnostmi tumorjev glave in vratu ter jih izkoristili za napoved razvoja, zdravljenja in ponovitve bolezni.
Tako smo v zdravem in tumorskem tkivu 34 bolnikov z rakom glave in vratu, s pomočjo metode RT-qPCR, proučili izražanje genov DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3 in TRDMT1.
Ugotovili smo povezavo med izražanjem TRDMT1, kliničnimi parametri in dejavniki tveganja, vključno z mestom nastanka tumorja, kadilskim statusom, uživanjem alkohola ter HPV okužbo. Stopnja izražanja TRDMT1 je bila povezana z napredovanjem/agresivnostjo bolezni, in sicer se z znižanjem TRDMT1 stopnja napredovanja agresivnosti viša. Pri analizi izražanja DNA metilaz in demetilaz v odvisnosti od prisotnosti ali odsotnosti zasevkov v področnih bezgavkah v tumorskem tkivu smo ugotovili trend povišanega izražanja DNA metilaz in demetilaz v zgodnjih stadijih ter trend znižanega izražanja DNA metilaz in demetilaz v poznih stadijih.
V ta namen bi bilo smiselno raziskavo razširiti na večje število vzorcev, s čimer bi se posledično povečala statistična moč analize, ki bi lahko prispevala k razjasnitvi vloge izražanja DNA in RNA metilaz ter demetilaz kot potencialnih kazalcev za klasifikacijo bolnikov in določitev ocene napredovanja bolezni.
Keywords: rak glave in vratu, metilaze, demetilaze, relativna genska ekspresija, tumorsko tkivo
Published in DKUM: 13.09.2022; Views: 605; Downloads: 86
Full text (3,48 MB) |
3. Subcelična frakcionacija humanih mononuklearnih celic periferne krvi in izolacija proteinov iz različnih celičnih kompartmentov : diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnjeDea Simonič, 2021, undergraduate thesis Abstract: Mononuklearne celice periferne krvi (MCPK) so ključna komponenta imunskega sistema za boj proti infekcijam in prilagajanje patogenom. MCPK se nahajajo v periferni venski krvi in predstavljajo lahko dostopen vir imunskih celic za nadaljnje imunske in toksikološke raziskave, pomembne so pri analizi genske in proteinske ekspresije v krvi, proteini MCPK pa predstavljajo pomembne biomarkerje imunskih in možganskožilnih bolezni.
V večini standardnih postopkov lize celice se za tvorbo celičnega lizata uporablja en sam lizni pufer, kar lahko vodi do nespecifičnih interakcij proteinov, raztapljanja proteinov v pufru, ki jih ne želimo analizirati, prav tako so možne težave s topnostjo proteina v pufru. Analiza proteinov s subceličnim frakcioniranjem (s sekvenčno uporabo več liznih pufrov) pa med drugim poveča možnosti, da je željeni protein izoliran in bistveno zmanjša možnost kontaminacije z drugimi proteini. Subcelično frakcioniranje prav tako omogoča pridobitev informacije o tem kako se porazdelitev posameznih proteinov razlikuje med različnimi subceličnimi kompartmenti, celicami in tkivi, ter daje informacijo o stanju celic in o aktivaciji signalnih poti.
V diplomski nalogi smo optimizirali protokol za izolacijo proteinov s subcelično frakcionacijo iz svežih MCPK, povzet iz članka Holden P., Horton W. A.: Crude subcellular fractions of cultured mammalian cell lines, ki opisuje optimizacijo protokola za gojene celične linije sesalcev. V sklopu naloge smo optimizirali koncentracijo digitonina v digitonin pufru in volumne ostalih pufrov za subcelično frakcionacijo. Optimiziran protokol za izolacijo proteinov s subcelično frakcionacijo svežih MCPK smo primerjali z izolacijo proteinov z dodatkom enega samega liznega pufra ter izbrane optimizirane pogoje preverili tudi na zamrznjenih MCPK. Vse izolirani proteine smo analizirali z metodo western prenosa (WB) in rezultate kvantificirali s programom ImageLab.
S testiranjem različnih koncentracij digitonina v digitonin pufru in na podlagi WB analize za proteinske markerje α-tubulin, citratna sintaza (CS) in histonska deacetilaza 6 (HDA-C6) smo ugotovili, da je optimalna koncentracija digitonina v digitonin pufru, za izolacijo le citosolnih proteinov svežih vzorcev MCPK, 50 μg/mL. Z optimizacijo koncentracije digitonina in volumnov dodanih liznih pufrov smo ločeno izolirali citosolne proteine, proteine membranskih organelov, jedra in netopnih proteinov. Ugotovili smo, da je izplen izoliranih proteinov pri izolaciji s subcelično frakcionacijo večji kot pri direktni izolaciji proteinov z dodatkom enega samega liznega pufra.
Keywords: MCPK, subcelična frakcionacija, izolacija proteinov iz različnih celičnih kompartmentov, lizni pufri, western prenos
Published in DKUM: 22.09.2021; Views: 1594; Downloads: 146
Full text (13,19 MB) |
4. Razvoj humanega sferoidnega 3-dimenzionalnega celičnega modela za testiranje učinkovin za zdravljenje raka glave in vratu na principu zaviranja matičnih celic rakaLarisa Goričan, 2020, doctoral dissertation Abstract: Za ponovitve tumorjev in razvoj oddaljenih metastaz so odgovorne na primarno zdravljenje odporne celice raka z izvornimi lastnostmi, ti. matične celice raka (MCR). MCR predstavljajo kritično podskupino rakastih celic, ki imajo sposobnost samoobnavljanja in diferenciacije ter ohranjajo tumor tudi po tem, ko primarno zdravljenje uniči večino preostalih celic tumorja. Omenjena spoznanja so vodila v iskanje terapij, ciljanih na MCR. Zaradi potrebe po terapijah ciljanih na MCR in njihove redkosti v primarnih tkivih je narasla potreba po modelu za obogatitev MCR, ki bi omogočil obogatitev MCR ter hkrati dopuščal proučevanje učinkovin z aktivnostjo usmerjeno proti MCR z analizami visokozmogljivih presejalnih testov (VPT). V ta namen smo v sklopu doktorske naloge iz komercialne epitelne celične linije PCKGV razvili humani sferoidni tri-dimenzionalni (3D) celični model (SM) obogaten za MCR, primeren za testiranje aktivnih učinkovin za zdravljenje PCKGV. Omenjeni sferoidni model združuje prednosti in zaobide omejitve dveh trenutno najpogosteje uporabljanih tehnik nasajanja sferoidov, kulture prosto-plavajočih sfer (oz. model tumorske sfere) in modela večceličnega tumorskega sferoida (MVTS). Podobno kot v modelu prostoplavajočih sfer, smo v SM uporabili medij za spodbujanje in ohranjanje matičnosti. Slednji za razliko od običajnega medija ne vsebuje seruma ploda goveda (»fetal bovine serum« - FBS), znanega sprožilca diferenciacije, ter je dopolnjen z več dejavniki, ki spodbujajo rast matičnih celic (osnovni fibroblastni rastni faktor, epidermalni rastni faktor, sestavljen komercialni pripravek, im. B-27). Za razvoj SM smo uporabili komercialno dostopno, stabilno celično linijo, ki za razliko od primarnih celičnih kultur, omogoča izvedbo dalj časa trajajočih eksperimentov, ponovitve posameznih eksperimentov, ne zahteva invazivnih metod pridobivanja, prav tako pa omogoča uporaba takšnih linij večjo primerljivost rezultatov med različnimi raziskovalnimi skupinami / eksperimenti. Podobno kot v MVTS smo za nasaditev SM uporabili mikrotitrsko ploščico z zaobljenim dnom in neoprijemljivo podlago, ter večjo koncentracijo celic nasadili na posamezno jamico in ploščico po nasaditvi zavrteli. Omenjeno je omogočilo generacijo celične mase in kasneje kompaktnega sferoida. Razviti SM smo primerjali z adherentno celično kulturo in MVTS, pri čemer je SM pokazal večjo obogatitev markerjev matičnosti, tako na transkripcijskem, kot proteinskem nivoju.
Nadalje smo s pomočjo tretiranja sferoidov z diferenciacijskim medijem z dodano retinojsko kislino (»all-trans retionic acid« - ATRA) uspeli izbrati nabor specifičnih kazalcev za zaznavo MCR-diferenciacijskega učinka. Eksperiment z ATRA potrjuje občutljivost SM na delovanje učinkovin in njegovo uporabnost za detekcijo aktivnosti učinkovin z delovanjem proti MCR na treh različnih nivojih, tj. transkripcijskem, proteinskem in na nivoju celičnega cikla. V končnem eksperimentu s peptidnimi frakcijami kostnega mozga smo na SM uspeli identificirati šest frakcij s statističnim trendom zvišanja/ znižanja ekspresije enega ali več markerjev matičnosti.
V doktorski nalogi razviti SM za obogatitev matičnih celic raka predstavlja kompromis med kompleksnostjo tumorja in preprostostjo protokola. Je primer preprostega modela sferoidov, ki ga tvori samo ena vrsta celic. Čeprav ne zajame kompleksnosti pravega tumorja, zagotavlja visoko obogatitev MCR ter zaradi enostavne vzpostavitve modela, uniformnosti, kratkega časa gojenja in prostorske ločitve sferoidov, ki omogoča dodajanje ene same aktivne sestavine posameznemu sferoidu, omogoča identifikacijo učinkovin z aktivnostjo proti MCR v analizah VPT. Takšen preprost model omogoča cenejšo identifikacijo prvih spojin in zožitev izbora učinkovin za nadaljnjo validacijo v bolj kompleksnih in dragih sferoidnih ali živalskih modelih.
Keywords: Ploščatocelični karcinom glave in vratu, matične celice raka, 3D / sferoidna kultura / model, visokozmogljivi presejalni testi, učinkovine z delovanjem proti matičnim celicam raka, retinojska kislina, markerji matičnosti
Published in DKUM: 27.11.2020; Views: 1399; Downloads: 144
Full text (3,81 MB) |
